dPCR 入门

dPCR 的发展

当今复杂的研究问题需要的信息深度超出了传统PCR技术的能力。第三代数字PCR缩小了这一差距，成为解决这些日常研究问题的更简单、更实用的技术。

数字 PCR 的概念出现于 1992 年，当时， Sykes 将其称为“有限稀释 PCR”。该通用方法采用了终点分析及泊松分布统计公式来量化样本中核酸分子的绝对数量。随后，Vogelstein 和 Kinzler 于 1999 年做出了重大贡献，他们开发出了一种方法，即，将样本稀释并分配至称为分区的单个反应单元中，并在扩增后检测及分析带有荧光信号的单个产物。当时他们创造了“数字 PCR”这个沿用至今的术语。

多年来，人们对这些方法进行了创新和商业化，以扩大其应用范围。数字 PCR 可在微流控芯片及微流磁盘、微阵列及基于油水乳液的微液滴或液滴晶体上进行；最近以来，还可在类似 qPCR 的孔板中进行。

数字 PCR 是一项高度精确的技术，可实现高灵敏性和高度可重复性的核酸检测及定量。其测定方法包括将样本微分化到多个反应分区中，单个反应分区中只包含零个、一个或多个靶标分子。每个微分区在终点PCR扩增后分析荧光信号存在(阳性反应)或不存在(阴性反应)，并计算样品中存在的靶标分子的绝对数量。采用该技术进行样本靶标基因定量时，无需依赖标准曲线。消除对标准曲线的依赖可以减少误差并提高精度。

分而治之

虽说样本制备步骤与 qPCR 相同，但是数字 PCR 中有一个独特的“微分化”步骤，在这个步骤中，样本在扩增前被微分化成成千上万个独立的反应单元。与 qPCR 中的整体分析不同，数字 PCR 通过将核酸分子随机分配到各反应分区中，可有效地减少竞争靶点的影响，提高了对罕见物的检测精度和灵敏度。

研究者可使用数字 PCR 来：

• 定量低丰度靶标或复杂背景中的靶标
• 检测和区分等位基因突变（SNP）
• 监测 qPCR 无法检测到的靶标基因微小倍数变化

泊松分布法则为微分化带来意义

与实时 qPCR 不同，数字 PCR 不依赖于每个扩增循环后荧光信号的检测以确定靶标分子的相对定量；它依赖于泊松分布统计公式以确定终点扩增后靶标分子的绝对定量。

鉴于靶标分子被随机分配至所有有效的反应分区中，泊松分布可估计每个反应分区的平均分子数目（零个、一个或多个），并计算出每个反应分区中的靶标分子的拷贝数。对阳性和阴性反应分区数目进行泊松分布统计分析可获得靶标序列的准确绝对数量。