dPCR与qPCR的选择 – 探索相关优势,并查看是否适合您的研究目地
在对 dPCR 和 qPCR 这两种技术进行比较时,关键差异在于精确度。国家计量实验室首席科学家 Jim Huggett 表示,虽然两者都可进行高度灵敏且可靠的核酸检测和定量,这两种技术间的主要区别可以用模拟和数字收音机来类比。“对于模拟收音机,首先必须先对调节器进行精确的调节,才能以最低的干扰接收想要的频道。尽管如此,信号的质量还是取决于接收情况,而且会受到静电的干扰。这就像 qPCR 一样。它是可靠的,但需要进行优化,才能获得良好的结果,即便如此,还是会有背景噪音。对于数字收音机,你只需拨到相应的频道,频道上或者有清晰的信号,或者没有信号。后者类似于dPCR,提供精确的二进制结果。它直接计数 DNA 分子的存在或不存在。清晰的结果与低出错率的结合造就了极高的精确度。数字 PCR 非常适合检测及定量较小的差异。”
比较与对比:qPCR 与 dPCR
real-time PCR/ qPCR | 数字 PCR |
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定量,绝对或相对, 但需要标准曲线或参照品 |
定量,绝对且无需标准品或 参照品 |
主体 PCR
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样本微分化
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每个循环均检测 PCR的扩增情况 | PCR 循环结束后进行检测 |
可检测 >1% 的突变率 | 可检测≥ 0.1% 的突变率(高 信噪比) |
方案成熟 | 更高的精确度带来更高的 实验室间可重复性 |
相对于 qPCR,应在何时使用 dPCR ?
当涉及到核酸定量的分子生物学和基因组学研究时,科学家们经常发现自己站在十字路口。为了更有效地实现研究目标,应该选择哪种量化技术,是更精确、更稳健的数字PCR (dPCR)还是更规范、更熟悉的定量 real-time PCR (qPCR) ? 这两种技术有相似之处,但它们的优点和局限性也依赖于所选择的应用程序。
该应用网格中给出了每种技术对某些常见应用的适用水平。
微滴式数字 PCR (ddPCR) 是数字 PCR 最早的形式之一,在上述大多数应用中已经展现出优于 qPCR 的优势。在 ddPCR 与 qPCR 的对比中,qPCR 适用于需要宽动态范围的应用,而 ddPCR 适用于需要更高精确度或丰度分析的应用。
从 ddPCR 到纳米微孔板 dPCR 的发展,拓宽了这项技术的应用范围。得益于同时读取所有样本反应分区、前端自动化以及类似于 qPCR 的简单微孔板设置,纳米微孔板 dPCR 的工作流程显著加快。这种加快的速度使其适用于筛选和高通量应用,而不会影响其精确度、准确度和灵敏度。