scientist working on a computer
数字 PCR

dPCR 与 qPCR

在对 dPCR 和 qPCR 这两种技术进行比较时,关键差异在于精确度。国家计量实验室首席科学家 Jim Huggett 表示,虽然两者都可进行高度灵敏且可靠的核酸检测和定量,这两种技术间的主要区别可以用模拟和数字收音机来类比。“对于模拟收音机,首先必须先对调节器进行精确的调节,才能以最低的干扰接收想要的频道。尽管如此,信号的质量还是取决于接收情况,而且会受到静电的干扰。这就像 qPCR 一样。它是可靠的,但需要进行优化,才能获得良好的结果,即便如此,还是会有背景噪音。对于数字收音机,你只需拨到相应的频道,频道上或者有清晰的信号,或者没有信号。后者类似于dPCR,提供精确的二进制结果。它直接计数 DNA 分子的存在或不存在。清晰的结果与低出错率的结合造就了极高的精确度。数字 PCR 非常适合检测及定量较小的差异。”

比较与对比:qPCR 与 dPCR

研究者看重 qPCR 的速度、灵敏度、特异性和易用性。该技术在进行基因表达分析、病原体检测和微生物组分析以及微阵列数据验证时最有用。然而,对于比如拷贝数变异分析、突变检测和 SNP 以及等位基因分型等要求优异的准确性和灵敏性的应用而言,qPCR 则无法胜任。在此类应用中,dPCR 优于 qPCR 之处在于,dPCR 不仅可检测及定量绝对拷贝数,还可以克服检测局限性,即可检出以 10% 精确度表示的微小倍数变化以及 <1% 的突变率。

数字 PCR 还显示出稳健的定量能力,即,由于采用了样本微分化及终点PCR法,该技术对 PCR 抑制剂有较高的耐受性,且受 PCR扩增效率变化的影响较小。

real-time PCR/ qPCR 数字 PCR
定量,绝对或相对,
但需要标准曲线或参照品
定量,绝对且无需标准品或
参照品

主体 PCR

  • 反应体积灵活
  • 因数据在指数扩增阶段收集,
    因而受 PCR 效率变化的影响
  • 易受抑制剂影响

样本微分化

  • 更高的抑制剂
    耐受性/更好的稳健性
  • 不受扩增效率
    变化的影响
  • 泊松分布统计下具有
    更高的统计学功效
每个循环均检测 PCR的扩增情况 PCR 循环结束后进行检测
可检测 >1% 的突变率 可检测≥ 0.1% 的突变率(高
信噪比)
方案成熟 更高的精确度带来更高的
实验室间可重复性

即使有诸如腐殖酸和肝素等抑制剂存在的情况下,dPCR 反应仍可稳定扩增。qPCR(Rotor-Gene Q )和 dPCR(QIAcuity )反应分别使用各自的预混液(EvaGreen)和存在一定量抑制剂的相同的反应体系。定量结果以 Cq (qPCR) 或拷贝/µl (dPCR)显示,将不含抑制剂的样本的扩增性能设为 100%,以便于比较样本间的相对性能差异。
即使有诸如腐殖酸和肝素等抑制剂存在的情况下,dPCR 反应仍可稳定扩增。qPCR(Rotor-Gene Q )和 dPCR(QIAcuity )反应分别使用各自的预混液(EvaGreen)和存在一定量抑制剂的相同的反应体系。定量结果以 Cq (qPCR) 或拷贝/µl (dPCR)显示,将不含抑制剂的样本的扩增性能设为 100%,以便于比较样本间的相对性能差异。
qPCR 中 1个Cq 表示 50% 分辨度,且对应 2 倍的浓度变化,对标dPCR中可实现10% 的分辨度。

相对于 qPCR,应在何时使用  dPCR ?

当涉及到核酸定量的分子生物学和基因组学研究时,科学家们经常发现自己站在十字路口。为了更有效地实现研究目标,应该选择哪种量化技术,是更精确、更稳健的数字PCR (dPCR)还是更规范、更熟悉的定量 real-time PCR (qPCR) ? 这两种技术有相似之处,但它们的优点和局限性也依赖于所选择的应用程序。

该应用网格中给出了每种技术对某些常见应用的适用水平。

微滴式数字 PCR (ddPCR) 是数字 PCR 最早的形式之一,在上述大多数应用中已经展现出优于 qPCR 的优势。在 ddPCR 与 qPCR 的对比中,qPCR 适用于需要宽动态范围的应用,而 ddPCR 适用于需要更高精确度或丰度分析的应用。

从 ddPCR 到纳米微孔板 dPCR 的发展,拓宽了这项技术的应用范围。得益于同时读取所有样本反应分区、前端自动化以及类似于 qPCR 的简单微孔板设置,纳米微孔板 dPCR 的工作流程显著加快。这种加快的速度使其适用于筛选和高通量应用,而不会影响其精确度、准确度和灵敏度。

查看 dPCR 可为您做些什么
在当前,数字 PCR——特别是QIAGEN的纳米微孔板技术正在从根本上改变你今天可以回答的问题,使广泛的应用成为可能。

认识 2021 年 APHL dPCR 资助金获得者

美国田纳西州卫生部媒介传播疾病项目主任 Abelardo Moncayo 博士是 QIAGEN 与 APHL 合作的数字 PCR 技术使用资助金的 2021 年获得者。听听他打算如何使用数字 PCR 来指导针对蚊子和蜱虫的研究和监测策略。
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