当涉及到核酸定量的分子生物学和基因组学研究时，科学家们经常发现自己站在十字路口。为了更有效地实现研究目标，应该选择哪种量化技术–是更精确、更稳健的数字PCR (dPCR)还是更规范、更熟悉的定量 real-time PCR (qPCR) ? 选择哪种技术将取决于具体的应用。对于感兴趣的读者，这篇文章将就这两代 PCR 技术的演变及实际应用提供简要的阐述。
自 1993 年发明以来，qPCR 一直因其速度、灵敏度、特异性和易用性而受到研究者们的青睐。该技术最为有用的场景包括：基因表达实验、SNP 检测、基因分型或等位基因鉴别及微阵列数据的验证。经过精心设计的 qPCR 检测方法可在每个反应体系中检出某个靶序列的多个拷贝，从而具有宽广的动态定量范围。用户可自行选择化学试剂检测法，从嵌入性染料 (SYBR Green) 到靶标特异性探针（TaqMan、分子信标等）。1 每份样本的成本具有很高的灵活性，可根据反应体积、通量和检测方法而不同，以满足特定的研究需求。此外，qPCR MIQE 指南的发表提高了实验室间的一致性，并提高了实验的可重复性。2
然而，对于要求卓越准确性和灵敏性的应用（例如拷贝数变异和罕见事件检测），qPCR 则难以胜任。在此类应用中，dPCR 优于 qPCR 之处在于，dPCR 不仅测量了绝对拷贝数，还可以克服检测局限性，即可检出小倍数差异和低丰度靶标，换句话说，可以完成大海捞针的任务。数字 PCR 消除了对标准曲线的需求，且由于对反应分区进行终点荧光判读，对抑制物影响的敏感性较低。由于消除 PCR 效率偏差，降低错误率，这一点受到科学界的一致赞赏。3
富有讽刺意味的是，尽管 20 世纪 90 年代早期就已出现“有限稀释 PCR”或“数字 PCR”，但他的发展进程很快就因 real-time PCR 的到来而受到阻碍。4,5 为什么呢？因为缺乏仪器和化学试剂。幸运的是，近期发表的一篇综述为该技术的未来描绘了一幅光明的图景。6 数字 PCR 采用的是一种直截了当的非黑即白的方法，该方法与持续性技术改进的结合及其 MIQE 指南的发表使得研究人员对探索其潜力的兴趣再次复燃。7 如今，越来越多的科研人员将dPCR用于研究癌症基因突变、监测免疫治疗效果、检测病原体、分析转基因生物、评估基因编辑频率以及遗传疾病的产前检测，从而扩大了其应用领域。8
2.Bustin S.A. et al.The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.Clin Chem 2009;55:611–622.
3.Taylor S.C. et al.Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data.Sci.Rep.2017;7:2409-2417.
4.Sykes P.J. et al.Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.BioTechniques.1992;13(3):444–449.
5.Morley A.A.Digital PCR: a brief history.Biomol.Detect.Quantif.2014;1:1–2.
6.Quan P.L. et al. dPCR: A technology review.Sensors (Basel).2018;18 pii:E1271.
7.Huggett J.F. et al.The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments.Clin.Chem.2013, 59, 892– 902.
8.Baker M. Digital PCR hits its stride.Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.
自 1993 年发明以来，qPCR 一直因其速度、灵敏度、特异性和易用性而受到研究者们的青睐。该技术最为有用的场景包括：基因表达实验、SNP 检测、基因分型或等位基因鉴别及微阵列数据的验证。经过精心设计的 qPCR 检测方法可在每个反应体系中检出某个靶序列的多个拷贝，从而具有宽广的动态定量范围。用户可自行选择化学试剂检测法，从嵌入性染料 (SYBR Green) 到靶标特异性探针（TaqMan、分子信标等）。1 每份样本的成本具有很高的灵活性，可根据反应体积、通量和检测方法而不同，以满足特定的研究需求。此外，qPCR MIQE 指南的发表提高了实验室间的一致性，并提高了实验的可重复性。2
然而，对于要求卓越准确性和灵敏性的应用（例如拷贝数变异和罕见事件检测），qPCR 则难以胜任。在此类应用中，dPCR 优于 qPCR 之处在于，dPCR 不仅测量了绝对拷贝数，还可以克服检测局限性，即可检出小倍数差异和低丰度靶标，换句话说，可以完成大海捞针的任务。数字 PCR 消除了对标准曲线的需求，且由于对反应分区进行终点荧光判读，对抑制物影响的敏感性较低。由于消除 PCR 效率偏差，降低错误率，这一点受到科学界的一致赞赏。3
富有讽刺意味的是，尽管 20 世纪 90 年代早期就已出现“有限稀释 PCR”或“数字 PCR”，但他的发展进程很快就因 real-time PCR 的到来而受到阻碍。4,5 为什么呢？因为缺乏仪器和化学试剂。幸运的是，近期发表的一篇综述为该技术的未来描绘了一幅光明的图景。6 数字 PCR 采用的是一种直截了当的非黑即白的方法，该方法与持续性技术改进的结合及其 MIQE 指南的发表使得研究人员对探索其潜力的兴趣再次复燃。7 如今，越来越多的科研人员将dPCR用于研究癌症基因突变、监测免疫治疗效果、检测病原体、分析转基因生物、评估基因编辑频率以及遗传疾病的产前检测，从而扩大了其应用领域。8
前进的道路
无论是 real-time PCR 还是数字 PCR 技术，都显现出巨大的增长潜力。qPCR 技术仍将是实验室中的标准主力技术，同时，dPCR 令人赞叹的灵敏性、精确性、稳健性和可重复性将可协助科研人员推进已知世界的疆域。随着尖端的基于纳米微孔板的 dPCR 技术的引入，考虑向数字转型的实验室将从该技术的多通道及高通量性能中获益。工业界及学术界都需要适应这样的竞争性环境，并在不断变化的PCR世界中找到他们的完美平衡。参考文献
1.Deepak S.A. et al.Real-Time PCR: Revolutionizing detection and expression analysis of genes.Curr.Genom.2007;8:234–251.2.Bustin S.A. et al.The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.Clin Chem 2009;55:611–622.
3.Taylor S.C. et al.Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data.Sci.Rep.2017;7:2409-2417.
4.Sykes P.J. et al.Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.BioTechniques.1992;13(3):444–449.
5.Morley A.A.Digital PCR: a brief history.Biomol.Detect.Quantif.2014;1:1–2.
6.Quan P.L. et al. dPCR: A technology review.Sensors (Basel).2018;18 pii:E1271.
7.Huggett J.F. et al.The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments.Clin.Chem.2013, 59, 892– 902.
8.Baker M. Digital PCR hits its stride.Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.