克隆和 DNA 重组

E. coli DNA 聚合酶 I 的 5'→3' 核酸外切酶活性使其不适合许多应用。Klenow Fragment 是包含 5'→3' 聚合酶和 3'→5' 校对核酸外切酶的大结构域，它缺乏这种活性，从而适合许多有用的研究应用，包括从单链模板合成双链 DNA、末端补平 DNA 片段的 3' 末端使 5' 单链突出端变平、消化掉突出的 3' 单链突出端以及制备标记的 DNA 探针。 

正如 E. coli DNA 聚合酶 I 的 5'→3' 核酸外切酶活性可能不受欢迎一样，Klenow Fragment 的 3'→5' 核酸外切酶活性对于某些应用也可能不受欢迎。这个问题可以通过引入突变来克服，这些突变会导致 Klenow Fragment (3'→5' exo-) 酶保留 5'→3' 聚合酶活性，但缺乏任何核酸外切酶活性。Klenow Fragment (3'→5' exo-) 可用于微阵列的一些荧光标记反应，以及加 dA 和 dT 尾，这是将 DNA 接头连接到 DNA 片段过程中的重要步骤，经常用于制备用于新一代测序的 DNA 文库

T4 噬菌体的 DNA 聚合酶是聚合酶家族 A 成员，后者包括 E. coli DNA 聚合酶 I、Taq DNA 聚合酶和线粒体 DNA 聚合酶。T4 DNA 聚合酶可用于有效地使用标记或未标记的 dNTP 补平 5’-单链突出端，或者用于使带有 3'-单链突出端的 DNA 分子产生平端。T4 DNA 聚合酶具有模板依赖性，需要引物，并且缺乏 5’→3’ 核酸外切酶功能。T4 DNA 聚合酶可在不依赖连接的情况下用于 PCR 产物的克隆。 

不依赖连接的克隆 (Ligation Independent Cloning, LIC) 是限制酶/连接酶克隆的一种替代技术。插入片段通过 PCR 扩增，载体通过限制酶消化或 PCR 实现线性化。LIC 利用 T4 DNA 聚合酶的 3’→5’ 核酸外切酶活性在载体和插入片段之间产生具有互补性的单链突出端。在一步式 SLIC（不依赖序列和连接的克隆）中，线性化的载体和 PCR 扩增的插入片段在单个试管中混合，并使用 T4 DNA 聚合酶进行处理。通过将混合物在冰上孵育来终止反应，并且在将混合物引入感受态 E. coli 细胞后修复缺口和单链突出端。

T4 DNA 连接酶是实验室研究中最常用和最通用的连接酶，因为该酶可以连接 DNA 和寡核苷酸的黏端或平端。T4 DNA 连接酶可以修复双链 DNA 中的单链切口，但不能连接单链核酸。T4 DNA 连接酶可以与处于 RNA:DNA 杂合体中的 RNA 分子结合。使用 T4 DNA 连接酶连接 DNA 黏端可以在 12–16°C 下进行，以确保酶活性和退火的 DNA 单链突出端的稳定性之间的良好平衡。T4 DNA 连接酶可以通过在 65°C 下孵育 10 分钟而被热灭活。