数字 PCR 工作流程和产品

您可以参阅我们的 《QIAcuity 应用指南》 ，以获取详细的指南和有关如何设置数字 PCR  实验的分步讲解教程。还请参阅 《数字 MIQE 指南》 及其 更新版 （Huggett JF et al，2013 和 2020），以了解在设计数字 PCR 实验及报告相关结果时应考虑的其他事项。 

QIAcuity 是从覆盖着薄膜的平板底部读取其发射出的荧光信号。为了获得最佳结果，请保持薄膜的清洁并避免其受损，比如划痕。此外，请保持孔板侧面条形码的清洁和完整。确保在操作孔板时戴手套，且不要对孔板施加压力。为了确保孔板操作安全，请将孔板放入纳米微孔板托盘中。

您的 dPCR 系统软件可为您提供一级和二级分析。一级分析可以包括浓度图、相关孔的分区视图或热图，以便靶标通道与参比通道进行对比。您可以使用直方图和散点图来更改阈值设置。在二级分析中，您可以根据应用目的（突变检测、基因表达分析等）对 PCR 数据进行分析。

数字 PCR 的引物设计原则与 qPCR 类似。您应该注意靶标匹配、碱基组成、扩增子长度、解链温度、二级结构、自身互补和相互互补（自我退火）以及交叉反应。一个不同之处在于，dPCR 的引物通常使用比 qPCR 更高的浓度，以便更好地从背景噪音中分离特定信号。

对于绝大多数 QIAcuity dPCR 应用，模板 DNA 将被均匀分布到 QIAcuity 纳米微孔板反应室中。以 PCR 产物或高度片段化 DNA（FFPE DNA、循环细胞游离DNA）、互补 DNA (cDNA)、gBlocks 等为模板的 QIAcuity 反应分区中，可以观察到 PCR 信号的均匀分布。然而，>20 kb 的 DNA 分子或质粒的分布是不均匀的，这可导致模板浓度的过度定量。通过将限制性酶直接添加到 QIAcuity 反应混合物中可将大片段模板酶切成较小的片段，从而获得均匀的模板分布和准确的定量。在拷贝数变异（CNV）分析中，某个基因的多个拷贝可能存在串联现象，因而，限制性消化对拷贝数变异分析而言尤为重要。在将限制性酶添加到反应混合物中时，用户必须确保该酶不会对扩增子的内部进行剪切。我们建议将限制性酶添加至预混液中，并在加入模板后室温孵育 10 分钟。

 QIAcuity dPCR 系统可检测 FAM、 EvaGreen、VIC、HEX、 TAMRA、 ROX 和 Cy5 等染料。

所有在反应混合物使用的 DNA 样本都应显出相似的品质和含量——可通过紫外分光光度法测定。平均长度 ≥ 20 kb 的 DNA 样本（例如，采用硅胶膜柱纯化的基因组 DNA）在微分化前应先进行酶切处理。对较长 DNA 片段，进行酶切处理可确保模板在整个 QIAcuity 纳米微孔板上的均匀分布，因而可获得准确和精确的定量。