illustration of people in lab coats working on dna

PCR

细胞系工程

尽管 CRISPR 和其他细胞工程技术取得了进步，但从起始细胞到获得改良细胞的道路仍然漫长且棘手。如果有一种方法可以改进和加速您的细胞系开发工作流程，同时发现基因组的任何意外变化，情况又会如何呢？

概览

细胞系工程的缺点
  • 鉴于基因编辑技术的成功率很低，筛选成功编辑的克隆并对这些编辑进行表征可能需要数月时间才能完成。
  • 基因编辑、病毒转导甚至常规转染都会导致脱靶效应，例如染色体重排和结构突变，而这些往往会被核型分析和 FISH 等经典方法忽略。
为期一周：
为期一周：
  • 转染
  • 转导
  • CRISPR 基因编辑
为期数月：
为期数月：
  • 克隆选择
  • Sanger 测序
  • qPCR 验证
  • 基因表达分析
CRISPR 和 QuantiNova 试剂盒
为期数周：
为期数周：
  • 基因组完整性评估
  • 脱靶分析
  • RNA 测序
Epitect HI-C Kit
在克隆选择和细胞系表征工作流程中，不要为了质量而牺牲速度，而是应该将两者结合起来
Cell line developement benefits illustration

克隆选择和富集

CRISPR 筛选需要花费您数周的时间吗？

从您的 CRISPR 基因编辑表征中削减不必要的任务。观看视频了解相关信息。


如何更快和更容易地对您的 CRISPR 基因编辑进行表征
以 3 倍的速度找到您的目标克隆

仅需 10 个细胞/µL 即可在 3 天内对 CRISPR 基因编辑进行表征。 

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hands in blue gloves marking petri dish
基因表达分析——使用 QuantiNova PCR 在转录水平对基因编辑进行验证
person working in lab
直接利用细胞进行 qPCR

最大限度减少识别目标克隆所需的时间和工作量。

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准备好加速您的克隆选择工作流程了吗？
访问我们的专用页面，详细了解 QIAprep&amp CRISPR Kit 以及 QuantiNova 一步法 RT-qPCR 解决方案
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细胞系表征

在 5 天内揭示真实的基因组状态
观看此视频，了解一种简单而精细的方法，用于发现您的工程化细胞中出现的意外基因组变化。
在细胞系开发的早期识别染色体改变
为什么选择 EpiTect Hi-C 而不是核型分析或 FISH？ 

与经典方法相比，EpiTect Hi-C 可以让您对基因组有 10 倍分辨率的了解，从而揭示染色体重排和结构突变等基因组盲区。 浏览此彩页了解更多信息。 

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提前应对潜伏在细胞中的意外变化
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常见问答

CRISPR 筛选
使用包被的培养皿处理培养细胞时，有什么需要考虑的事项吗？是否需要额外的纯化步骤来消除或减少包被试剂，例如聚-L-赖氨酸？
QIAprep&amp CRISPR 样本制备及靶标扩增不受包被试剂的影响。可在附录 C 中的 QIAprep&amp CRISPR 和 CRISPR-Q 定制试剂盒手册中获取更多信息以及经测试的包被试剂清单。
在使用经过聚凝胺处理的转导细胞进行实验时，有什么需要考虑的事项吗？
QIAprep&amp CRISPR Kit 中随附的 AllTaq PCR 试剂在面对抑制剂时非常稳健。样本制备不受影响，PCR 反应耐受性高达 1 µg/mL。
新的 CRISPR PCR Assay 能否用于 QIAcuity 数字PCR (dPCR)？您是否有相关数据或实验方案？
CRISPR-Q Custom PCR Assay 不适用于 dPCR。它用于在标准 PCR 仪中进行常规 PCR，然后在 QIAxcel 或凝胶上对 PCR 产物进行分析。CRISPR-Q Custom PCR Assay 包含 2 条位于切割位点两侧的引物。目的是对克隆进行快速 PCR 检查，并为后续 Sanger 测序制备模板。对于 Sanger 测序，使用相应的 CRISPR-Q Sanger Primer。dPCR 是通过Sanger 测序对编辑事件进行检查的一种替代方案，并且对相应事件具有特异性。
EpiTect Hi-C
在 EpiTect Hi-C 工作流程中有停止点吗?
有。在 Hi-C 第 1 部分工作流程中的 Hi-C 消化、Hi-C 末端标记、Hi-C 连接或染色质解交联步骤之后，用户可将样本保持在 −15 至 −25°C ，并在以后继续后面的操作步骤。
每份样本使用超出建议范围的投入量会产生什么影响？
每份样本使用超出 5 x 103 和 2.5 x 106 个人类或小鼠细胞（或相当于 30 ng–15 µg DNA）范围的投入量可能会影响所得到的二代测序 (NGS) 文库的质量，从而可能出现更高水平的内向 (inward-facing, FR) 序列读取偏倚、未连接的末端以及包含连续、重新连接的限制性片段的reads对。
我能否使用先前交联和冷冻的细胞（例如，用于 ChIP 或 ChIP-seq 实验的细胞）作为 EpiTect Hi-C 实验的起始材料？
可以。然而，应使用 1% 甲醛对细胞进行交联，并且冷冻时间不得超过 6 个月。
我可以使用哪种平台进行测序？
EpiTect Hi-C 测序文库与所有 Illumina 测序平台兼容。
我能否使用自己的流程来分析 EpiTect Hi-C 实验的结果？
可以。为了进行分析，您需要以下附加信息。EpiTect Hi-C Kit 中使用的核酸内切酶在 GATC 位点进行切割。Hi-C 连接后产生的 Hi-C 连接基序（或标签）由 GATCGATC 序列组成。
应该使用何种reads读长对 EpiTect Hi-C NGS 文库进行测序？
可在 Illumina 测序仪上采用36–150 bp 的 reads 读长对 EpiTect Hi-C 文库进行测序。然而，由于覆盖率会随着 reads 读长的增加而增加，因此我们建议使用 2 x 150 bp 的测序读长以获得最佳结果。
QIAGEN 是否为 EpiTect Hi-C Kit 提供相应的数据分析？
是。访问 QIAGEN 的在线 GeneGlobe 数据分析中心 (qiagen.com)，在 Hi-C Analysis 中通过 EpiTect Hi-C 数据分析模板分析您的数据。
QuantiNova RT-PCR kit
使用 QuantiNova RT-qPCR Kit 直接裂解后，我是否需要任何特定设备对培养的细胞进行分析？
标准实验室设备和实时定量 PCR 循环仪均适用于该程序。如需选择合适的 assay，可通过 GeneGlobe 访问 QuantiNova LNA Assays，了解基于 SYBR Green 或探针法的 mRNA assay。
在直接 PCR 中检查我编辑的基因的基因表达水平需要多少个细胞？
QuantiNova 一步法 RT-qPCR 试剂盒甚至可以使用单个细胞检测 mRNA。然而，应该考虑所编辑的目标基因的预期丰度，以选择适当的细胞数量。建议每管 PCR 反应最多 2000 个细胞。
哪些细胞系适合进行直接裂解和 RT-qPCR？
各种细胞系均已成功用于所描述的直接 PCR 实验方案，并且所有常用的细胞系都应该适用于该程序。
在直接裂解和 RT-qPCR 之前是否需要洗涤细胞？
是的，在细胞培养物中会释放细胞外物质以及来自死细胞的碎片和细胞内物质，包括 RNA 或 RNA 酶和蛋白酶，所有这些都可能会干扰 RT-PCR。我们强烈建议通过使用细胞培养基冲洗细胞来去除上述物质。
我是否需要在冰上构建 RT-PCR 反应体系？
不，QuantiNova qRT-PCR Kit 使用两阶段一步法 qRT-PCR，逆转录酶和 Taq 聚合酶在常温下均保持处于失活状态，允许在常温下进行方便的反应体系构建，而不影响检测性能。