Enzyme für Assays & Detektion

Die T7-DNA-Polymerase selbst hat eine geringe Prozessivität. Sie löst sich von einem Primer-Template nach dem Einbau von < 15 nt. Bei der Infektion von E. coli dockt der T7-Phage an ein Wirtsprotein, Thioredoxin, an, das ihm als Prozessivitätsfaktor dient. T7-DNA-Polymerase und Thioredoxin verbinden sich im Verhältnis von 1:1, und die Bindung von Thioredoxin an die T7-DNA-Polymerase erhöht die spezifische Affinität der Polymerase für ein Primer-Template um den Faktor 80. Durch die erhöhte Affinität zum Primer-Template kann die T7-DNA-Polymerase einen Primer auf einzelsträngiger DNA um Tausende von Nukleotiden verlängern, ohne zu dissoziieren, was die kontinuierliche Synthese langer DNA-Abschnitte ermöglicht. Die T7-DNA-Polymerase kann zur Aufreinigung von kovalent geschlossener zirkulärer DNA durch Entfernung von Resten genomischer DNA und zur Synthese komplementärer cDNA-Stränge verwendet werden. 

Eine weitere Anwendung ist der In-situ-Nachweis von apoptotischer fragmentierter DNA durch Markierung von Einzelstrangbrüchen (nicks) in doppelsträngiger DNA. Die ausgeprägte Prozessivität, starke 3’→5’-Exonukleaseaktivität und die Fähigkeit, verschiedene markierte Nukleosidtriphosphate zu tolerieren, sind die wichtigsten Eigenschaften für den Einsatz der T7-DNA-Polymerase zur In-situ-Markierung von DNA-Schäden.

Der In-vivo-Comet-Assay ist ein bewährter Genotoxizitätstest, für den es eine OECD-Prüfrichtlinie gibt. In seiner Standardversion weist er DNA-Schäden in Form von Strangbrüchen und alkali-labilen Stellen nach. Die Aufnahme eines zusätzlichen Schritts in den Assay, bei dem die DNA mit einem läsionsspezifischen Enzym inkubiert wird, kann wichtige Erkenntnisse über die spezifische Art der DNA-Schäden liefern.

Die meisten Anwendungen des Reparatur-Assays sind im Human-Biomonitoring zu finden. Tagtäglich sind die Menschen mutagenen und karzinogenen Verbindungen ausgesetzt, sowohl am Arbeitsplatz als auch in der Umwelt. Was die berufliche Exposition anbelangt, so sind die Menschen in verschiedenen Berufen genotoxischen/mutagenen Verbindungen ausgesetzt, z. B. Pestiziden, Haarfärbemitteln, Formaldehyd, antineoplastischen Mitteln, organischen Lösungsmitteln usw.

Die Comet-Assay-Technik basiert auf der Elektrophorese einzelner Nukleoide (DNA, die nach der Zelllyse und dem Strippen von Histonen an die Kernmatrix gebunden ist), was ein kometenartiges Bild ergibt, wobei die Intensität des Schweifs von der Häufigkeit der Brüche abhängt, die zur Entspannung des Supercoilings führen und die Wanderung der DNA-Schleifen mit den Brüchen ermöglichen. Durch das Aufschließen der Nukleoide mit läsionsspezifischen Endonukleasen lassen sich unterschiedliche DNA-Läsionen nachweisen.

Die Endonuklease VIII (Endo VIII) aus E. coli ist für die Entfernung eines breiten Spektrums oxidativ geschädigter Pyrimidinbasen verantwortlich, einschließlich der Radiolyseprodukte von Thymin, darunter Thymin-Glykol und Harnstoff. Das im Comet-Assay verwendete Enzym zeigt diese Klasse der DNA-Schädigung an. Endo VIII ist an der Basen-Exzisionsreparatur (BER) beteiligt und katalysiert die Hydrolyse der N-glykosidischen Bindung (N-Glykosylase-Aktivität). Infolgedessen bilden sich die modifizierte freie Base und die apurinische/apyrimidinische (AP-)Stelle. Die anschließende Spaltung der AP-Stelle erfolgt durch β, δ-Eliminierung (AP-Lyase-Aktivität) und führt zu einem einzelsträngigen DNA-Bruch. Der Assay erkennt den Bruch und die Läsion wird identifiziert.

Die DNase-I-Footprinting-Analyse von Endo VIII zeigt, dass das Protein an die DNA bindet, und zwar als kleiner Fußabdruck mit Kontaktstellen hauptsächlich auf dem beschädigten Strang.