Enzyme für die RNA-Analyse | Reverse Transkriptasen und RNA-Ligasen

Alles rund um die RNA: Amplifizieren, Sequenzieren, Ligieren und Markieren

Es steht eine Reihe von Enzymen zur Verfügung, um RNA für die nachgeschaltete Analyse der Genexpression zu bearbeiten. Reverse Transkriptasen erzeugen aus einem Transkript komplementäre DNA (cDNA). Die cDNA kann markiert oder für Klonierungs- und quantitative Studien amplifiziert werden. RNA-Ligasen verbinden Basen, Markierungen und Adapter, RNA-Polymerasen fügen Ribonukleotide hinzu und Ribonukleasen entfernen sie.

RNA durch Amplifikation nachweisen und bearbeiten

Reverse Transkriptasen sind Enzyme, die einen DNA-Strang (cDNA) polymerisieren können, der komplementär zu einem ursprünglichen RNA-Template ist. RNA ist anfällig für den Abbau durch RNasen, und der Einsatz eines Reverse-Transkriptase-Enzyms zur Bildung von cDNA überwindet die Probleme der Arbeit mit mRNA. Die cDNA wird zum stabilen Template für eine Vielzahl von nachgeschalteten Anwendungen für RNA-Untersuchungen, wie beispielsweise für die Analyse der Genexpression. Für die Amplifikation des cDNA-Templates können reguläre PCR-, qPCR-, einstufige RT-qPCR- oder isotherme Verfahren genutzt werden. Nach der Amplifikation kann die Klonierung mit herkömmlichen Enzymprotokollen oder durch ligationsunabhängige Klonierung unter Nutzung der 3’→5’-Exonukleaseaktivität der T4-DNA-Polymerase erfolgen.

Alle Reverse-Transkriptase-Enzyme (RNA-abhängige DNA-Polymerasen) können wie nachstehend genannt eingesetzt werden:

cDNA-Synthese

cDNA-Erststrang-Synthese
Synthese von doppelsträngiger cDNA für die Klonierung

Bei der RT von mRNA, die mit Oligo(dT) geprimt wurde, entsteht ein erster cDNA-Strang mit einer Schleife am 3'-Ende. Nach Entfernung der mRNA verbleiben einsträngige cDNA-Moleküle mit der 3'-Schleife, die von der reversen Transkriptase als Primer für die cDNA-Zweitstrangsynthese genutzt werden können.

cDNA-Amplifikation

Reverse Transkription (RT) und RT-PCR
Quantitative Real-time RT-PCR

Bei der RT wird isolierte mRNA mit reverser Transkriptase und genspezifischen Primern, Oligomeren mit zufälliger Sequenz oder Oligo(dT) in cDNA umgewandelt. Die RT-PCR beginnt mit der RT und verwendet die cDNA für die PCR-Amplifikation. Die RT-qPCR kombiniert die PCR-Amplifikation mit der Detektion und Quantifizierung in einem einzigen Assay.

mRNA-Analyse

Primer-Extension
cDNA-Markierung

Bei der Primer-Extension wird der Transkriptionsstartpunkt eines Gens durch Identifizierung des 5'-Endes der kodierten mRNA mittels Analyse eines cDNA-Zwischenprodukts bestimmt. Bei direkten cDNA-Markierungsprotokollen werden modifizierte dNTPs verwendet, die während der RT-Reaktion eingebaut werden.

		RNase H (+/-)	Spezielle Anwendungen
P7600L EnzScript	Demnächst erhältlich	Minus	Für lange cDNAs und Bibliotheken mit einem hohen Anteil an Volllängen-cDNA; Anwendungen, die einen Template-Wechsel erfordern, z. B. RNA-Seq
P7720L StableScript	Demnächst erhältlich	Minus	Für lange cDNAs; verbesserte Prozessivität, Inhibitorresistenz und Thermostabilität (optimale Temperatur von 55 °C)
205111 Omniscript Kit		Plus	Markierung für Microarrays; speziell entwickelt für die reverse Transkription mit beliebigen RNA-Mengen; optimierter Puffer; kein RNase-H-Schritt erforderlich

RNA-Polymerasen und -Ligasen

RNA-Polymerasen, oder genauer: DNA-abhängige RNA-Polymerasen, sind Enzyme, die RNA ausgehend von einem DNA-Template synthetisieren. Das Enzym Poly(A)-Polymerase verwendet einsträngige RNA als Primer, um einen Poly(A)-Schwanz an die RNA anzuhängen, indem es den Einbau von Adeninresten an den 3’-Enden der RNA katalysiert.

T4-RNA-Ligasen sind nützliche Enzyme für die RNA-Analyse, insbesondere im Vorfeld von Verfahren wie der Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und Microarrays. Die T4-RNA-Ligasen 1 und 2 sind Enzyme, die eine Markierung, Zirkularisierung oder intermolekulare Ligation der RNA durchführen können, indem sie benachbarte 3'-OH- und 5'-PO4-Polynukleotide verbinden. Die Anbindung von Adaptern an RNA-3'-Enden mit T4-RNA-Ligase 1 ist ein hilfreicher erster Schritt für die Quantifizierung und Entdeckung von RNA durch RT-PCR und Hochdurchsatzsequenzierung.

		Aktivität	Anwendungen
P7180L T7 RNA Polymerase	Demnächst erhältlich	Synthetisiert RNA in 5’→3’-Richtung vom DNA-Template; spezifisch für den T7-Promotor	mRNA-Synthese in vitro Markierung von RNA-Sonden Gewinnung von RNA für RNA-Studien Expressionskontrolle mittels Anti-Sense-RNA sgRNA-Synthese
P7460L Poly(A)-Polymerase	Demnächst erhältlich	Katalysiert die Addition von AMP aus ATP an 3’-OH der RNA für Poly(A)-Schwanz-RNA	3'-Markierung von RNA mit ATP oder Cordycepin Poly(A)-Schwanzsynthese der RNA Poly(A)-Schwanz verstärkt die Translation von RNA nach Transfer in eukaryotische Zellen
L6050L T4 RNA Ligase 1	Demnächst erhältlich	Einzelstrang-RNA-Ligase; verknüpft auch einsträngige DNA-Moleküle	Ligation von einsträngiger RNA oder DNA 3'-Endmarkierung von einsträngiger RNA oder DNA
L6080L T4 RNA Ligase 2	Demnächst erhältlich	Ligiert Einzelstrangbrüche (nicks) der dsRNA; kann das 3’-OH der RNA an das 5’-PO4 der DNA in Doppelstrang-Hybriden ligieren	Verbindung mehrerer Oligonukleotide mittels Template Synthese von RNAs mit ortsspezifischen Modifikationen oder Markierungen Nick-Ligation der dsRNA Ligation von 3’-OH der RNA an 5’-PO₄ der DNA in einem DNA/RNA-Duplex
L6070L T4 RNA Ligase 2 (Truncated)	Demnächst erhältlich	Katalysiert die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einem prä-adenylierten 5’-Phosphat (DNA oder RNA) und dem 3’-Hydroxyl der RNA	Linker-Ligationen mit prä-adenylierter 5’-DNA an’ 3’-Hydroxyl der RNA Klonierung und Sequenzierung kleiner RNAs

Verdau und Schutz von RNA

Der Ribonuklease-Schutzassay (RPA) mit dem Enzym RNase A ist eine Technik zur Bestimmung der relativen bzw. absoluten Transkriptionshäufigkeit und zur Kartierung von mRNA-Enden und Intron/Exon-Grenzen.

Einzelbasensubstitutionen können mit einem einfachen Enzymverfahren nachgewiesen und lokalisiert werden, bei dem RNase A einzelne Basenfehlpaarungen in RNA:DNA-Heteroduplexen spaltet.

		Aktivität	Anwendungen
19101 RNase A		Endoribonuklease, die ssRNA an C- und U-Resten abbaut*	Bestimmung der relativen oder absoluten Transkriptionshäufigkeit Kartierung von mRNA-Enden und Intron/Exon-Grenzen (RPA) Kartierung einzelner Basenmutationen in DNA und RNA Entfernung von RNA aus Plasmid- und genomischen DNA-Präparaten Entfernung von RNA aus rekombinanten Proteinpräparaten
Y9220L RNase H	Demnächst erhältlich	Endoribonuklease, die die Phosphodiesterbindungen der an die DNA hybridisierten RNA hydrolysiert	Die RNase-H-Aktivität baut das RNA-Template eines DNA:RNA-Komplexes ab und setzt dabei einsträngige cDNA als Template für die cDNA-Zweitstrang-Synthese frei
Y9240L RNase Inhibitor	Demnächst erhältlich	Vom Schwein stammender, nicht-kompetitiver Inhibitor der RNase A, B und C; hemmt nicht die Aktivität der RNase H.	Schützt RNA vor Abbau; wird häufig als Schutzmaßnahme bei der enzymatischen Bearbeitung der RNA eingesetzt

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Häufige Fragen zur RNA-Analyse

Die reverse Transkriptase (RT), auch als RNA-abhängige DNA-Polymerase bekannt, ist ein DNA-Polymerase-Enzym, das Einzelstrang-RNA in DNA transkribiert. Die retrovirale RT weist drei aufeinander folgende biochemische Aktivitäten auf: RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität, Ribonuklease H (RNase H) und DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität. Zusammen ermöglichen diese Aktivitäten dem Enzym, Einzelstrang-RNA in Doppelstrang-cDNA umzuwandeln. Reverse Transkriptasen werden von Viren wie HIV und Hepatitis B zur Replikation ihrer Genome eingesetzt. Reverse Transkriptasen werden auch von mobilen genetischen Retrotransposon-Elementen verwendet, um sich im Wirtsgenom zu vermehren, und von eukaryotischen Zellen, um die Telomere an den Enden ihrer linearen Chromosomen zu verlängern.

Reverse Transkriptasen werden in der Molekularbiologie zur Detektion und Veränderung von RNA-Molekülen durch einen Amplifikationsprozess verwendet. Ausgangspunkt für die Neusynthese ist ein kurzes DNA-Oligonukleotid, ein sogenannter Primer, der an das RNA-Template gebunden wird. Die reverse Transkriptase polymerisiert einen DNA-Strang, der komplementär zur ursprünglichen RNA-Vorlage ist; dieser wird als cDNA bezeichnet. Die cDNA kann dann durch PCR, quantitative PCR oder isotherme Verfahren weiter amplifiziert werden.

Die RNA-Polymerase öffnet lokal die Doppelstrang-DNA, so dass ein Strang der freigelegten Nukleotide als Vorlage für die RNA-Synthese dienen kann; dies ist der Prozess der Transkription. Bei der DNA-Replikation trennt eine DNA-Helikase die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix und bildet eine als Replikationsgabel bezeichnete Struktur, die zwei Einzelstränge freilegt. Replikative DNA-Polymerasen verwenden dann jeden Strang als Vorlage, um einen neuen passenden DNA-Strang zu bilden. Bei der DNA-Transkription sorgt die RNA-Polymerase für das Abwickeln der DNA und die Synthese der prä-mRNA.

Die Primase ist eine DNA-abhängige RNA-Polymerase mit einer wichtigen Rolle bei der DNA-Replikation. Nach dem Abwickeln der elterlichen DNA durch die Helikase an einer Ursprungsstelle baut die Primase an jedem Strang des Templates einen kurzen RNA-Primer auf, der von der replikativen DNA-Polymerase mit Desoxynukleotiden verlängert wird. Die RNA-Polymerase II, das Enzym, das in Eukaryonten mRNA ausgehend von DNA synthetisiert, benötigt für den Synthesestart keinen Primer. Ob ein Primer benötigt wird, ist bei den viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerasen unterschiedlich. Reverse Transkriptasen benötigen einen tRNA-Primer.

Eukaryotische Zellen enthalten drei RNA-Polymerasen, die unterschiedliche Genklassen transkribieren. Proteinkodierende Gene werden von der RNA-Polymerase II transkribiert; die RNA-Polymerasen I und III transkribieren ribosomale RNAs (rRNAs) und Transfer-RNAs (tRNAs). Die Transkription des mitochondrialen Genoms erfolgt durch eine RNA-Polymerase, die entfernt mit der Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase verwandt ist.

Die Poly(A)-Polymerase oder Polynukleotid-Adenylyltransferase katalysiert den Einbau von Adeninresten an den 3’-Enden der RNA unter Einsatz von Einzelstrang-RNA als Primer und fügt der RNA effektiv einen Poly(A)-Schwanz hinzu. Die Poly(A)-Polymerase ist eine Template-unabhängige Polymerase, die zur großen Superfamilie der Nukleotidyltransferasen der Familie X gehört, zu der auch die terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) zählt.

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