Klonierung und DNA-Rekombination

'Sticky' oder 'blunt': Modifikation, Annealing und Ligation

Technologien zur Klonierung und DNA-Rekombination konnten bereits zu vielen Erkenntnissen über die Funktionsweise von Genen und Zellen bei Gesundheit und Krankheit beitragen. Dank moderner Klonierungstechnologien und -applikationen stehen heute weitere innovative Anwendungen wie die Hochdurchsatz-Assemblierung von kombinatorische Bibliotheken und die Kartierung epigenetischer Modifikationen zur Verfügung.

Enzyme für die Klonierung

Eine Endmodifikation kann erforderlich sein, damit die Template-DNA in einen geeigneten Plasmidvektor kloniert werden kann. Die für die Klonierung identifizierte DNA wird in der Regel durch Verdau mit Restriktionsenzymen oder PCR-Amplifikation aus der Quelle isoliert. Spezialisierte Enzyme wie das Klenow-Fragment, die T4-DNA-Polymerase und die T4-Polynukleotidkinase modifizieren 3’- oder 5’-Enden, um die kovalente Bindung zwischen DNA-Fragmenten und Vektor zu verbessern.

Der nächste Klonierungsschritt ist die Ligation mit einem Enzym, das sich für das Annealing der Enden von Vektor und Insert eignet.

Tailing erfolgt in der Regel zur Vorbereitung eines T-Vektors für die Verwendung in der TA-Klonierung oder für die Polyadenylierung bei einem durch eine High-Fidelity-Polymerase (nicht Taq) erzeugten PCR-Produkt, das in der TA-Klonierung verwendet werden soll. Die Produkte der Amplifikation mittels Taq-DNA-Polymerase weisen bereits einen Poly(A)-Schwanz auf.

Enzyme für die Endmodifikation von DNA

Enzym	Endmodifikation
	Endfüllung 5’→3’	Endfüllung 3’→5’	Polyadenylierung für die Klonierung	Phosphorylierung am 5’-Ende
P7060L Klenow Fragment Demnächst verfügbar	✔ Ja	✔ Ja	✘ Nein	✘ Nein
P7080L T4 DNA-Polymerase*	✔ Ja	✔ Ja	✘ Nein	✘ Nein
P7010 Klenow (3’→5’-Exo-)	✘ Nein	✘ Nein	✔ Ja	✘ Nein
Y9040L T4 Polynukleotid-Kinase	✘ Nein	✘ Nein	✘ Nein	✔ Ja
Y9140† Endreparatur-Mix	✔ Ja	✔ Ja	✘ Nein	✔ Ja

Enzyme für die DNA-Ligation

Enzym	Ligation
	Ligation von kohäsiven Enden	Ligation von stumpfen Enden	Nick-Versiegelung
*L6090L E. coli* DNA-Ligase** Demnächst verfügbar	✔ Ja	✘ Nein	✔ Ja
L6010L T3 DNA-Ligase Demnächst verfügbar	✔ Ja A/T > G/C [1,0 M NaCl]	✔ Ja	✔ Ja
L6030 T4 DNA-Ligase Demnächst verfügbar	✔ Ja	✔ Ja	✔ Ja
EN11 T4 DNA Ligase BLIRT	✔ Ja	✔ Ja	✔ Ja
L6020L T7 DNA Ligase Demnächst verfügbar	✔ Ja	✘ Nein	✔ Ja
EN13 Tth DNA Ligase*	✔ Ja	✘ Nein	✔ Ja
L6060L Taq DNA Ligase^†Demnächst verfügbar	✘ Nein	✘ Nein	✔ Ja

Klonierung auf die SLIC-Art

Die sequenz- und ligationsunabhängige Klonierung (SLIC) nutzt die Exonuklease-Enzymaktivität:

Klonierung für Next Generation Sequencing

Eine für Next Generation Sequencing vorgesehene Bibliothek geht von fragmentierter DNA aus. Enzymaktivitäten vervollständigen die Klonierungsschritte.

icon-genomicsStumpfe Fragmente
Mit den Enzymen T4-DNA-Polymerase, Klenow-Fragment und T4-PNK werden stumpfe Enden generiert und 5’-phosphoryliert.
icon-bio-informaticsEnden polyadenylieren
Als nächstes werden die 3’-Enden mit einem der folgenden Enzyme polyadenyliert: Taq-DNA-Polymerase oder Klenow-Fragment (3’→5’-Exo-).
icon-barcodeAdapter anfügen
Mit dem letzten Enzym, der T4-DNA-Ligase, werden durch Ligation komplementäre Adapter oder Barcodes angefügt.

Alle erforderlichen Enzymkomponenten für die DNA-Bibliothekserstellung können mit Adaptern zu einem „selbstgemachten“ Bibliothekserstellungs-Kit zusammengestellt werden.

Gensynthese

Die Gensynthese basiert auf der Verbindung von Oligodesoxynukleotiden, die lange Regionen komplementärer Überhänge aufweisen.

icon-temperatureThermostabile Taq DNA Ligase
Verbessern Sie die Synthese durch Verwendung thermostabiler Taq-DNA-Ligase anstelle von T4-DNA-Ligase.

Höhere Ligationstemperaturen erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Bildung korrekter Ligationsprodukte.
icon-targetNick-selektive Ligase

Verwenden Sie eine Nick-selektive Ligase, um Deletionen zu vermeiden, die durch die Ligation über Lücken hinweg entstehen.

Lange synthetisierte DNAs werden nicht auf falsche Weise zusammengefügt.

Entdecken Sie die vorgestellten Enzyme für Klonierung und DNA-Rekombination

FAQs über Enzyme für Klonierung und Rekombination

Haben Sie noch Fragen?

Benötigen Sie weitergehende Informationen zu unseren Enzymen?
Bauen Sie ein neues Labor auf? Die nächstgelegene Vertriebsvertretung freut sich auf Ihre Kontaktaufnahme.

Kontaktieren Sie uns