Markierung von Nukleinsäuren

Die DNA-Polymerase I, codiert durch das polA-Gen, war die erste DNA-Polymerase, die entdeckt wurde, und ist die häufigste Polymerase in E. coli (ca. 400 Moleküle je Zelle). Sie ist ein Beispiel für ein prozessives Enzym, da sie nacheinander mehrere Polymerisationsschritte katalysieren kann, ohne das einzelsträngige Template freizugeben. Das Polypeptid weist zwei funktionelle Domänen auf: eine große Domäne (Klenow-Fragment), welche die 5'→3'-Polymerase und die 3'→5'-Proofreading-Exonuklease enthält, und ein kleines Fragment, das eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität enthält. Durch letztere Aktivität ist die DNA-Polymerase I in der Lage, RNA-Primer zu entfernen, die zur Initiierung des downstream befindlichen Okazaki-Fragments verwendet werden. Die Hauptfunktion der Polymerase in vivo ist die Beteiligung an Rekombination und DNA-Reparatur. Bei der DNA-Reparatur füllt die DNA-Polymerase I Lücken in der DNA auf, die durch die Entfernung von DNA-Läsionen entstanden sind. 

Zu den Applikationen in der Forschung zählen die DNase-I-abhängige Nick Translation, die Synthese des zweiten Stranges bei der cDNA-Klonierung und das Auffüllen von 5´-Überhängen. DNA-Polymerase I baut biotinylierte Nukleotide ein.

Die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase I von E. coli macht sie für viele Anwendungen ungeeignet. Dem Klenow-Fragment, der großen Domäne, welche die 5'→3'-Polymerase und 3'→5'-Proofreading-Exonuklease enthält, fehlt diese Aktivität. Dadurch eignet es sich für viele nützliche Forschungsapplikationen wie die Synthese doppelsträngiger DNA aus einzelsträngigen Templates, das Auffüllen zurückgezogener 3'-Enden von DNA-Fragmenten, um 5'-Überhänge stumpf zu machen, den Verdau vorstehender 3'-Überhänge und die Vorbereitung markierter DNA-Sonden. 

So wie die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase I von E. coli unerwünscht sein kann, ist bei bestimmten Applikationen auch die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität des Klenow-Fragments unerwünscht. Dieses Problem lässt sich lösen, indem Mutationen eingebracht werden, um ein Klenow-Fragment(3'→5'-Exo)-Enzym zu erhalten, das die 5'→3'-Polymerase-Aktivität aufweist, dem aber die Exonuklease-Aktivität fehlt. Das Klenow-Fragment (3'→5'-Exo-) wird bei einigen Fluoreszenzmarkierungsreaktionen für Mikroarrays und beim Anhängen von dA- und dT-Schwänzen verwendet, einem wichtigen Schritt im Prozess der Ligation von DNA-Adaptern an DNA-Fragmente, welcher häufig bei der Vorbereitung von DNA-Bibliotheken für das Next Generation Sequencing angewandt wird.

Die T7-DNA-Polymerase selbst hat eine geringe Prozessivität. Sie löst sich von einem Primer-Template nach dem Einbau von < 15 nt. Bei der Infektion von E. coli dockt der T7-Phage an ein Wirtsprotein, Thioredoxin, an, das ihm als Prozessivitätsfaktor dient. T7-DNA-Polymerase und Thioredoxin verbinden sich im Verhältnis von 1:1, und die Bindung von Thioredoxin an die T7-DNA-Polymerase erhöht die spezifische Affinität der Polymerase für ein Primer–Template um den Faktor 80. Durch die erhöhte Affinität zum Primer–Template kann die T7-DNA-Polymerase einen Primer auf einzelsträngiger DNA um Tausende von Nukleotiden verlängern, ohne zu dissoziieren, was die kontinuierliche Synthese langer DNA-Abschnitte ermöglicht. Die T7-DNA-Polymerase kann zur Aufreinigung von kovalent geschlossener zirkulärer DNA durch Entfernung von Resten genomischer DNA und zur Synthese komplementärer cDNA-Stränge verwendet werden. 

Die Poly(A)-Polymerase oder Polynukleotidadenyltransferase katalysiert den Einbau von Adeninresten an die 3’-Enden von RNA unter Verwendung einzelsträngiger RNA als Primer, wobei effektiv ein Poly(A)-Schwanz an der RNA angefügt wird. Die Poly(A)-Polymerase ist eine Template-unabhängige Polymerase, die zur großen Superfamilie der Nukleotidyltransferasen der Familie X gehört, zu der auch die terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) zählt.

Die Polyadenylierung ist ein wesentlicher Schritt bei der mRNA-Reifung; der Poly(A)-Schwanz am 3’-Ende der mRNA erleichtert den mRNA-Transport aus dem Zellkern, verbessert die Translationseffizienz und erhöht die Lebensdauer der mRNA im Zytoplasma. Bei Eukaryoten ist der für die Polyadenylierung zuständige Apparat physikalisch an den für die mRNA-Spaltung gekoppelt. Die Generierung des polyadenylierten 3’-Endes einer mRNA erfordert eine endonukleolytische Spaltung, bevor die Prä-mRNA durch die Poly(A)-Polymerase polyadenyliert werden kann. 

In der Molekularbiologie steigert ein durch Poly(A)-Polymerase angefügter Poly(A)-Schwanz die Translation von in eukaryotische Zellen eingebrachter RNA. Andere Applikationen umfassen die Polyadenylierung von RNA für die Klonierung oder Affinitätsaufreinigung und die 3’-Markierung von RNA mit ATP oder dem Nukleosidanalogon Cordycepin (3’-Desoxyadenosin).