scientist working on a computer
Digitale PCR

dPCR vs. qPCR

Beim Vergleich zwischen dPCR- und qPCR-Technologien ist der entscheidende Unterschied die Präzisionsleistung. Während beide eine hochsensitive und zuverlässige Nukleinsäuredetektion und -quantifizierung bieten, lässt sich der Hauptunterschied zwischen den beiden Technologien am besten anhand des Vergleichs von Analogradio und Digitalradio beschreiben, so Dr. Jim Hugget, Principal Scientist, National Measurement Laboratory. „Bei einem Analogradio muss zunächst das Einstellrad fein abgestimmt werden, um bei möglichst geringen Störungen die gewünschte Station zu erreichen. Trotzdem hängt die Qualität vom Empfang ab und das Signal unterliegt Störungen durch Rauschen. Das entspricht der qPCR. Sie ist zuverlässig, erfordert aber eine Optimierung, um gute Ergebnisse zu erhalten. Selbst dann ist Hintergrundrauschen unvermeidlich. Beim Digitalradio wird einfach die Station aufgerufen und sie ist entweder mit einem klaren Signal verfügbar oder eben nicht. Genauso ist es bei der dPCR, die präzise, binäre Ergebnisse liefert. Sie zählt wortwörtlich die An- oder Abwesenheit von DNA-Molekülen. Die Klarheit der Ergebnisse, kombiniert mit einer geringeren Fehlerrate, sorgt für eine unglaublich hohe Präzision. Die digitale PCR ist sehr gut zur Messung kleinerer quantitativer Unterschiede geeignet.“

Vergleich und Gegenüberstellung: qPCR vs. dPCR

Forscher schätzen die qPCR wegen ihrer Geschwindigkeit, Sensitivität, Spezifität und Benutzerfreundlichkeit. Die Technik ist am nützlichsten zur Durchführung von Genexpressionsanalysen, für den Pathogennachweis und Mikrobiom-Analysen sowie zur Validierung von Mikroarray-Daten. Bei Anwendungen, die eine herausragende Genauigkeit und Sensitivität erfordern, wie der Analyse von Kopienzahlvariationen oder dem Nachweis von Mutationen und SNPs und der Allelunterscheidung, gerät die qPCR jedoch an ihre Grenzen. Bei derartigen Anwendungen ist die dPCR der qPCR überlegen, da sie nicht nur die absolute Kopienzahl bestimmt, sondern auch die Einschränkungen der Nachweisgrenzen überwindet, d. h. sie ist in der Lage, geringfügige Unterschiede in Form von 10 % Präzision und Mutationsraten < 1 % nachzuweisen.

Dank Probenpartitionierung und Endpunkt-Thermocycling ermöglicht die digitale PCR auch eine robuste Quantifizierung, d. h. eine hohe Toleranz gegenüber PCR-Inhibitoren und eine geringere Beeinflussung durch Änderungen der PCR-Effizienz.

Real-time PCR/qPCR Digitale PCR
Quantitativ, relativ oder absolut, aber Standardkurven
oder Referenzproben sind erforderlich
Quantitativ, absolut und keine Standards
oder Referenzen erforderlich

Massen-PCR

  • flexible Reaktionsvolumen
  • beeinflusst durch Änderungen der PCR-Effizienz,
    da die Daten in der exponentiellen Phase erfasst werden
  • anfällig für Inhibitoren

Probenpartitionierung

  • höhere Toleranz gegenüber
    Inhibitoren/gesteigerte Robustheit
  • nicht beeinflusst durch Änderungen
    der Amplifikationseffizienz
  • höhere statistische Aussagekraft
    dank Poisson-Statistik
Misst PCR-Amplifikation in jedem Zyklus Misst nach Abschluss der PCR-Zyklen
Detektiert Mutationsraten > 1 % Detektiert Mutationsraten von ≥ 0,1% (hohes
Signal-zu-Rauschen-Verhältnis)
Gut etablierte Protokolle Höhere Präzision für höhere Reproduzierbarkeit
von Labor zu Labor

dPCR-Reaktionen bleiben auch in Gegenwart von Inhibitoren wie Huminsäure und Heparin robust. qPCR- (auf Rotor-Gene Q) und dPCR-Reaktionen (auf QIAcuity) wurden in Gegenwart angegebener Mengen an Inhibitoren mit dem entsprechenden QIAcuity PCR-Master-Mix (EvaGreen) und mit identischen Reaktionsvolumen durchgeführt. Die Quantifizierung zeigt Cq (qPCR) oder Kopien/µl (dPCR) als relative Unterschiede zwischen den Proben, wobei die nicht inhibierte Probe auf 100 % gesetzt wird.
dPCR-Reaktionen bleiben auch in Gegenwart von Inhibitoren wie Huminsäure und Heparin robust. qPCR- (auf Rotor-Gene Q) und dPCR-Reaktionen (auf QIAcuity) wurden in Gegenwart angegebener Mengen an Inhibitoren mit dem entsprechenden QIAcuity PCR-Master-Mix (EvaGreen) und mit identischen Reaktionsvolumen durchgeführt. Die Quantifizierung zeigt Cq (qPCR) oder Kopien/µl (dPCR) als relative Unterschiede zwischen den Proben, wobei die nicht inhibierte Probe auf 100 % gesetzt wird.
1 Cq in der qPCR, was für 50 % Präzision steht, ist gleichbedeutend mit 10 % Präzision in dPCR und entspricht einer 2-fachen Konzentrationssteigerung.

Wann ist dPCR und wann qPCR einzusetzen?

Wenn es bei der molekularbiologischen und Genomik-Forschung um die Quantifizierung von Nukleinsäuren geht, stehen Wissenschaftler häufig am Scheideweg. Welche Quantifizierungstechnik eignet sich besser, um die eigenen Forschungsziele möglichst effizient zu erreichen – die präzisere und robuste digitale PCR (dPCR) oder die standardisiertere und vertraute quantitative Real-time PCR (qPCR)? Beide Technologien haben Gemeinsamkeiten, aber auch jeweils eigene Vorzüge und Einschränkungen, die die Entscheidung anwendungsabhängig machen.

Das Anwendungsraster gibt den Grad der Eignung jeder Technologie für einige der gängigsten Anwendungen an.

Die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), eine der frühesten Formen der digitalen PCR, wies für die meisten der oben aufgeführten Applikationen bereits Vorzüge gegenüber der qPCR auf. Beim Vergleich ddPCR vs. qPCR eignet sich die qPCR für Applikationen, die einen breiten dynamischen Bereich erfordern, wohingegen die ddPCR für Applikationen zu bevorzugen ist, die eine höhere Präzision oder die Analyse der fraktionierten Abundanz erfordern.

Die Entwicklung von der ddPCR zur Nanoplatten-dPCR hat den Anwendungsbereich dieser Technologie erweitert, sodass nun noch mehr Applikationen möglich sind. Der Workflow der Nanoplatten-dPCR ist dank gleichzeitiger Auslesung aller Probenpartitionen, Front-End-Automation und der einfachen Platteneinrichtung ähnlich wie bei der qPCR deutlich schneller. Durch diese zusätzliche Geschwindigkeit eignet sich die Technologie für Screening- und Hochdurchsatz-Applikationen, ohne dass Abstriche bei Präzision, Genauigkeit und Sensitivität erforderlich sind.

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Die digitale PCR und insbesondere die Nanoplatten-basierte Technologie von QIAGEN machen es möglich, völlig neue Fragestellungen zu beantworten, wodurch sie für eine breite Palette an Anwendungen geeignet ist.

Lernen Sie den Gewinner des APHL dPCR-Stipendiums 2021 kennen

Dr. Abelardo Moncayo, Direktor des Vector-Borne Diseases Program, Tennessee Department of Health, hat 2021 den Digital PCR Technology Access Grant von QIAGEN in Verbindung mit APHL erhalten. Erfahren Sie, wie er die digitale PCR einsetzen möchte, um die Forschung und Überwachungsstrategien zur Bekämpfung von Mücken und Zecken voranzubringen.
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Diese Ressourcen haben das Ziel, all jenen, die den Wechsel zur dPCR in Betracht ziehen und ihr erstes Experiment planen möchten, wertvolle Ratschläge an die Hand zu geben.
Tipps und Tricks für die digitale PCR
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