Scientist analyzing dPCR results on dPCR system
DIGITALE PCR

dPCR-Assayentwicklung und -Fehlerbehebung

Digitales PCR-Protokoll — Übersicht

Bei der Entwicklung eines Assays für die digitale PCR (dPCR) sind viele Faktoren zu beachten – das Template, das verwendete Gerät, die Applikationen sowie die Ziele des Experiments. Die meisten Protokolle für die digitale PCR umfassen eine Variation der folgenden Schritte:

Die Probenvorbereitung ist ein wesentlicher Schritt zum Erreichen einer hohen PCR-Effizienz. Bei der Vorbereitung des Start-Templates für die digitale PCR sind mehrere wichtige Parameter zu beachten.

Zu diesen Parametern zählen:

  • Probenreinheit
  • Probenintegrität im Hinblick auf die Struktur
  • Probenlänge und -sequenz
  • Probeneinsatzmenge
  • Einsatz von Replikaten
  • Einsatz von Kontrollen

Im Folgenden wird erörtert, wie diese Faktoren optimiert werden können, um einen besseren dPCR-Lauf zu erreichen.

Pipetting as the first step of sample preparation in a dPCR protocol

Probenreinheit

Da bei einer PCR mehrere Zyklen enzymatischer Reaktionen stattfinden, ist sie anfälliger für Verunreinigungen z. B. durch Proteine, Phenol/Chloroform, Salze und EDTA als enzymatisch katalysierte Ein-Schritt-Reaktionen. Die Reinheit der Nukleinsäuren-Templates ist wichtig für die dPCR, da Kontaminanten mit dem Fluoreszenznachweis interferieren können.

  • Alkohole (Ethanol, Isopropanol) und Salze beeinträchtigen die Annealing-Eigenschaften von Primern und Sonden und reduzieren die Amplifikationseffizienz, was z. B. zu reduzierter Fluoreszenz von Positiven und einer erschwerten Unterscheidung zwischen positiven und negativen Partitionen führt.
  • Huminsäuren quenchen die Fluoreszenz von dsDNA-bindenden Farbstoffen wie z. B. EvaGreen
  • Nukleasen bauen RNA und DNA ab
  • Harnstoff und Phenol denaturieren die Taq-Polymerase
  • Saure Polysaccharide imitieren Nukleinsäuren und bilden Dead-End-Komplexe mit der Taq-Polymerase

Obwohl sie weniger anfällig für Hemmwirkungen ist als die qPCR, funktioniert die dPCR am besten, wenn Templates mit hoher Template-Reinheit eingesetzt werden. Es sind verschiedene Kits verfügbar, um abhängig vom Template, z. B. genomischer DNA, Plasmid-DNA, Gesamt-RNA usw., eine hohe Nukleinsäurereinheit und PCR-Effizienz zu erreichen.

Probenintegrität: Länge und Sequenz

Länge und Sequenz des Amplifikats haben einen ebenso großen Einfluss auf den Erfolg eines dPCR-Experiments wie die Template-Reinheit. Stark degradierte Template-RNA und -DNA weisen meist eine Diskrepanz zwischen OD-quantifizierter DNA-Menge und der Anzahl der mittels dPCR amplifizierten und nachgewiesenen Kopien auf. Um die gewünschte Sensitivität zu erreichen, kann eine größere DNA-Menge als erwartet erforderlich sein (z. B. beim Mutationsnachweis). Es ist empfehlenswert, die Amplifikate so kurz wie möglich zu halten, insbesondere bei Verwendung stark degradierter Proben (FFPE-DNA, cfDNA).

Auf ähnliche Weise können verbliebene Quervernetzungen die Strangtrennung und -amplifikation verhindern und abasische Stellen können eine unspezifische Amplifikation verursachen. Für die Gewinnung hochwertiger gDNA aus FFPE-Proben sind spezielle Kits und Protokolle verfügbar.

Probenintegrität: Struktur

Für die genaue Quantifizierung unter Verwendung eines dPCR-Protokolls ist die zufällige Template-Partitionierung von zentraler Bedeutung. Eine einheitliche Verteilung des PCR-Signals wird bei den meisten Arten von Template-DNA beobachtet, darunter formalinfixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE‑)DNA, zirkulierende zellfreie DNA (cfDNA), Komplementär-DNA (cDNA) und gBlocks.

Um eine einheitliche Verteilung von Templates mit hohem Molekulargewicht und komplexen Strukturen zu erreichen, empfiehlt sich der Einsatz von Strategien wie dem Restriktionsverdau.

dPCR

In den folgenden Fällen empfiehlt es sich, vor dem digitalen PCR-Assay einen Restriktionsverdau durchzuführen:

  • Hochviskose Lösungen – Eine hohe Viskosität könnte die Messgenauigkeit senken, besonders bei Einsatz hoher DNA-Mengen in kleineren Volumen. Mithilfe eines Restriktionsverdaus zur Senkung der Viskosität können im dPCR-Protokoll deutlich höhere DNA-Konzentrationen (1 µg) eingesetzt werden.
  • Verknüpfte oder Tandem-Genkopien – Wenn eine positive Partition mehrere Kopien enthält, werden die verknüpften Kopien als eine Kopie gezählt. Dieses Problem kann mittels Restriktionsverdau gelöst werden, durch welchen die Genkopien physikalisch voneinander getrennt werden und so unabhängig in verschiedene Partitionen migrieren können.
  • Supercoiled Plasmide – Ein Restriktionsverdau wird empfohlen, um die Plasmid-DNA zu linearisieren und die Zugänglichkeit und Effizienz der Primer-/Sondenbindung an die DNA zu verbessern. Dies verbessert die Genauigkeit der Plasmidquantifizierung.
  • Große DNA-Moleküle (> 30 kb) – Bei größeren DNA-Molekülen könnte es zu einer ungleichmäßigen Partitionierung kommen, welche zu einer Überquantifizierung der Template-Konzentration führen würde. Ein Restriktionsverdau fragmentiert die großen Templates in kleinere Abschnitte, was zu einer gleichmäßigen Verteilung und genaueren Quantifizierung verhilft.
Wichtiger Hinweis
Bei der Auswahl der Restriktionenzyme ist darauf zu achten, dass das Enzym nicht innerhalb der Amplifikat-Sequenz selbst schneidet.

Probeneinsatzmenge

Die Probeneinsatzmenge ist abhängig von der verwendeten dPCR-Technologie. Bei der digitalen Nanoplatten-PCR mit QIAcuity können in 26k-Nanoplatten bis zu 217 000 Kopien je Reaktion und in 8,5k-Nanoplatten bis zu 170 000 Kopien je Reaktion eingesetzt werden.

Berechnung der Kopienzahl

Wenn die haploide Genomgröße eines Organismus bekannt ist, kann die Korrelation zwischen der eingesetzten Masse an genomischer DNA (gDNA) und der resultierenden Kopienzahl (bei Genen mit nur einer Kopie) anhand folgender Formel berechnet werden:

Genomgröße (bp) x Durchschnittsgewicht eines einzelnen Basenpaars (1,096 x 10–21 g/bp) 

Für das menschliche Genom mit einer Genomgröße von etwa 3,3 x 109 bp sieht die Berechnung folgendermaßen aus:

3,3 x 109 bp x 1,096 x 10−21 g/bp = 3,3 x 10−12 g = 3,3 pg
In der nachstehenden Tabelle ist die Kopienzahl ausgehend von 10 ng gDNA für mehrere Modellorganismen aufgeführt.
Organismus Genomgröße Genkopien (1 Kopie/haploides Genom) in 10 ng gDNA
Homo sapiens 3,3 x 109 3000
Zebrafisch 1,7 x 109 5400
Saccharomyces cerevisiae 1,2 x 107 760.500
Escherichia coli 4,6 x 106 2.000.000
Standard-Plasmid-DNA 3,5 x 103 2.600.000.000

Wichtiger Hinweis
Bei der dPCR sollte die durchschnittliche Anzahl Kopien/Partition 5 nicht überschreiten. Idealerweise sollte sie im Bereich zwischen 0,5 und 3 liegen.

Replikate

Es empfiehlt sich, die Proben in Doppel- oder Dreifachbestimmung zu analysieren, um eine systematische Messabweichung bei der Quantifizierung aufgrund von Pipettierfehlern zu vermeiden. Das Zusammenfügen der Daten von Duplikaten erhöht die Anzahl gemessener Ereignisse. Dadurch wird die Präzision des digitalen PCR-Assays erhöht.

Kontrollen

  • Negativkontrollen – erforderlich zum Überwachen falsch positiver Reaktionen, welche aufgrund von Kontaminationen oder Problemen mit den Primern und Sonden auftreten können. Negativkontrollen werden auch eingesetzt, um die Nachweisgrenze (LOD) zu bestimmen.
  • Positivkontrollen – eingesetzt, um zu testen, ob die Template-Amplifikation unter den festgelegten Reaktionsbedingungen eintritt
  • Kontrollen ohne Template (NTCs) – Kontrolle auf Kontaminationen in allen Reagenzien
Digitale PCR auf dem QIAcuity-System: Eine Einführung
Das Webinar behandelt die verschiedenen grundlegenden Aspekte der digitalen PCR auf QIAcuity-Geräten, wobei besonderer Wert auf die Auswahl der Templates und ihrer Konzentrationen gelegt wird.

DNA-bindende Farbstoffe

Fluoreszierende interkalierende DNA-Farbstoffe wie etwa EvaGreen binden an alle doppelsträngigen DNA-Moleküle und emittieren bei der Bindung ein Fluoreszenzsignal mit definierter Wellenlänge. Die Signalintensität nimmt aufgrund der Akkumulation des PCR-Produkts mit steigender Zykluszahl zu. Die Verwendung DNA-bindender Farbstoffe wie EvaGreen ermöglicht die Analyse vieler verschiedener Targets und macht zugleich die Synthese Target-spezifischer markierter Sonden überflüssig. Unspezifische PCR-Produkte und Primer-Dimere könnten jedoch zum Fluoreszenzsignal beitragen und bei der Datenanalyse mittels digitaler PCR sogar als separate Cluster von Fluoreszenzsignalen auftreten. Eine hohe PCR-Spezifität ist bei Verwendung von EvaGreen-Farbstoff wesentlich. 

Fluorescence detection using DNA intercalating dyes in digital PCR
Fluorescence detection using primers/probes in digital PCR

Hydrolysesonden

Hydrolysesonden, genannt TaqMan-Sonden, sind sequenzspezifische Oligonukleotide mit einem gebundenen Fluorophor und Quencher-Rest. Ein Fluorophor bindet an das 5'-Ende der Sonde und ein Quencher an das 3'-Ende oder intern innerhalb der Sequenz von Interesse. Während der Elongationsphase der PCR wird die Sonde durch die 5′→3′-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase gespalten, wodurch Fluorophor und Quencher-Rest voneinander getrennt werden. Infolgedessen lässt sich ein Fluoreszenzsignal nachweisen, dessen Intensität proportional zur Menge des angereicherten PCR-Produkts ist.

Ein Tipp für die Fehlerbehebung bei der dPCR: Bestimmte Kombinationen aus Reporter und Quencher sollten vermieden werden. Wenn beispielsweise die Emission des Quenchers mit der Emission des Fluoreszenzfarbstoffs überlappt, führt dies im entsprechenden Fluoreszenzkanal zu zusätzlichen Hintergrundsignalen. Dieses Hintergrundrauschen beeinträchtigt die Cluster-Trennung und Peak-Auflösung. 

Ein effektives Primer- und Sondendesign ist für den Erfolg digitaler PCR-Assays unerlässlich. Das Primer- und Sondendesign bei einem dPCR-Protokoll folgt den gleichen Regeln wie bei qPCR-Assays. Die wichtigsten Punkte beim Primer- und Sondendesign umfassen:

  • Target-Übereinstimmung
  • Basenzusammensetzung
  • Amplifikatlänge
  • Schmelztemperatur
  • Abwesenheit von Sekundärstrukturen
  • Abwesenheit von Selbst- und Interkomplementarität (Self-Annealing)
  • Abwesenheit von Kreuzreaktivität
Optimizing primer design and probe design for digital PCR assays
Ein Unterschied beim Primer- und Sondendesign für ein digitales PCR-Protokoll ist, dass die Primer- und Sondenkonzentrationen bei der dPCR tendenziell höher sind als bei der qPCR. Höhere Primer- und Sondenkonzentrationen erhöhen die Fluoreszenzintensität/-amplitude und erlauben so eine bessere Trennung des Hintergrundrauschens von spezifischen Signalen. Letztlich ist damit eine genauere Target-Quantifizierung möglich. Es liegen Nachweise vor, dass optimale Ergebnisse bei Endkonzentrationen des Primer-Sets zwischen 0,5 µM und 0,9 µM und der Sonden von 0,25 µM je Reaktion erzielt werden.

Lagerung von Primern und Sonden

Neben einem sorgfältigen Assaydesign und der Verwendung geeigneter Primer- und Sondenkonzentrationen ist auch die korrekte Lagerung von Primern und Sonden für den Erfolg einer dPCR entscheidend.

Lyophilisierte Primer und Sonden sollten in einem kleinen Volumen eines salzarmen Puffers wie 100 µM TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0) aufgelöst werden, um eine konzentrierte Stammlösung herzustellen. Ausnahmen sind mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cy5 und Cy5.5 markierte Sonden. Diese sind in TE‑Puffer mit pH 7,0 aufzubewahren, da sie dazu neigen, sich bei höherem pH-Wert zu zersetzen.

Zur Lagerung der Primer können kleine Aliquote in nukleasefreiem TE‑Puffer bei -20 °C mindestens 1 Jahr lang aufbewahrt werden. Fluoreszenzmarkierte Sonden sind unter den gleichen Bedingungen 6 bis 9 Monate lang haltbar. Wiederholte Einfrier-/Auftauzyklen sind zu vermeiden, um das Risiko einer Zersetzung zu vermeiden.

Als Primer-Sonden-Sets für dPCR-Multiplex-Assays können 20x Primer-Sondenmischungen bestehend aus 2 Primern und 1 Sonde für ein bestimmtes Target in den vorgeschlagenen Konzentrationen verwendet werden.

Zur Rekonstitution von Primern und Sonden sollte ein Röhrchen mit einem lyophilisierten Primer oder einer lyophilisierten Sonde vorsichtig zentrifugiert werden, um das gesamte Material am Boden des Röhrchens zu sammeln. Anschließend sollte das erforderliche Volumen des sterilen, nukleasefreien TE‑Puffers zugegeben, gemischt und die Mischung 20 Minuten stehen gelassen werden, damit sich der Primer oder die Sonde vollständig auflösen kann. Die Primer- oder Sondenlösung sollte dann erneut gemischt und die Konzentration spektrophotometrisch bestimmt werden. Ein Tipp für die Fehlerbehebung bei der dPCR ist, das Auflösen der Primer und Sonden in Wasser zu vermeiden. Einige dieser Primer und Sonden sind in Wasser weniger löslich und stabil als in TE‑Puffer. 

A representation of the nanoplate dPCR workflow

Ein standardmäßiger Nanoplatten-dPCR-Workflow besteht aus drei wesentlichen Reaktionsschritten: Laden der Probe, Amplifikation und Datenanalyse.

Bei der Optimierung der dPCR-Reaktionsschritte können qPCR-Bedingungen, die zu hochwertigen qPCR-Ergebnissen führen, oftmals direkt auf die dPCR übertragen werden. Es empfiehlt sich jedoch immer, die Herstellerempfehlungen auf spezifische Anforderungen zu überprüfen. 

Tipps für das Laden der Probe

Der erste der drei dPCR-Reaktionsschritte ist das Vorbereiten und Laden der Probe. Bei der Vorbereitung des PCR-Gemischs und dem Laden auf die Nanoplatte sind die folgenden Empfehlungen zu berücksichtigen:

  • Dekontaminieren Sie Arbeitsbereich und Laborutensilien, um das Risiko einer Kontamination mit Fremd-DNA zu reduzieren.
  • Um eine maximale PCR-Effizienz zu gewährleisten, testen Sie die Probe vor dem tatsächlichen digitalen PCR-Assay in verschiedenen Verdünnungen.
  • Tauen Sie alle Komponenten vor dem Ansetzen von Reaktionsgemischen vollständig auf, mischen Sie die Komponenten gründlich, um homogene Lösungen zu erhalten, und zentrifugieren Sie kurz, um ein Überschwappen zu vermeiden.
  • Kombinieren Sie den Master-Mix mit Probe, Primern, RNase-freiem Wasser und Restriktionsenzymen (falls verwendet).
  • Verwenden Sie sterile Pipettenspitzen.
  • Pipettieren Sie das Reaktionsgemisch in die Nanoplatte. Achten Sie darauf, bei der Probenüberführung und dem späteren Transport der Platte keine Luftblasen in die Wells der dPCR-Nanoplatte einzubringen.
  • Um eine Verdampfung und Kontamination zu verhindern, versiegeln Sie die Nanoplatte unter Zuhilfenahme eines Rollers sorgfältig mit Folie.
  • Halten Sie die Nanoplatte beim Transport zum dPCR-Gerät nur an den Seitenkanten und achten Sie darauf, sie nicht zu schütteln oder umzudrehen, damit das dPCR-Reaktionsgemisch am Boden der Eingabe-Wells bleibt.
  • Richten Sie die Software ein und starten Sie den dPCR-Lauf.

Tipps für die Amplifikation

Der zweite der drei dPCR-Reaktionsschritte ist die Ausführung des dPCR-Protokolls mittels Amplifikation. Bei diesem Schritt wird das Reaktionsgemisch in jedem Well auf Tausende Einzelreaktionen aufgeteilt. Die PCR-Reaktion wird in einem Thermocycler durchgeführt. Wenn in einer Partition Template-Material vorhanden ist, wird bei der Bildgebung ein positives Fluoreszenzsignal detektiert. Die Bilder werden mit spezialisierter Software bearbeitet. Der aktuelle Plattenstatus kann in der Regel direkt am dPCR-Gerät oder über die verbundene Software-Suite überwacht werden.

Einige Tipps zum Erreichen optimaler Amplifikationsbedingungen und einer optimalen PCR-Effizienz:

  • Annealing-Temperatur – Sie kann die Spezifität des dPCR-Assays beeinflussen und liegt in der Regel zwischen 55 °C und 65 °C. Die optimale Annealing-Temperatur liegt dort, wo die größte Trennung zwischen positiven und negativen Partitionen erreicht wird. Eine Erhöhen der Annealing-Temperatur kann nützlich sein, um die Trennung zwischen positiven Signalen und Hintergrundrauschen zu verbessern.
  • Amplifikationszyklen – Es werden mindestens 40 Amplifikationszyklen je Lauf empfohlen, um eine ausreichende Trennung zwischen positiven Signalen und Hintergrundrauschen zu erreichen. In einigen Fällen muss die Anzahl der Temperaturzyklen ggf. erhöht werden, um eine optimale Leistung zu erzielen.

Im letzten der drei dPCR-Reaktionsschritte erfolgt die Datenanalyse für die digitale PCR mittels absoluter Quantifizierung auf Basis von Poisson-Statistik.

Die QIAcuity Software Suite kann die Datenanalyse für die digitale PCR entsprechend den Applikationszielen durchführen: absolute Quantifizierung, Mutationsnachweis, Genomediting, Kopienzahlvariation oder Genexpression. Bei der Analyse zur absoluten Quantifizierung (First-Level-Analyse) erstellt die Software ein Konzentrationsdiagramm und eine Ansicht der positiven und negativen Partitionen für ausgewählte Wells. Eine Heatmap zeigt den Target-Kanal neben dem Referenzkanal. Anhand von Histogrammen und Streudiagrammen können die Schwellenwert-Einstellungen geändert und die Ergebnisse neu berechnet werden. In der QIAcuity Software Suite können Sie Berichte über die Analyseergebnisse Ihrer Platte erstellen. Die absolute Quantifizierung ist die Voraussetzung für alle nachfolgenden Berechnungen und Second-Level-Analysen (z. B. Analyse zum Mutationsnachweis, Genexpressionsanalyse, Analyse von Kopienzahlvariationen usw.).

Tipps für die Datenanalyse bei der digitalen PCR: 

  • Legen Sie einen Schwellenwert für die Klassifizierung von Partitionen als positiv oder negativ fest, der knapp oberhalb des Clusters der negativen Partitionen liegt.
  • Verwenden Sie die NTC-Probe mit ausschließlich negativen Partitionen zum Festlegen des Schwellenwerts, führen Sie aber auch eine Inspektion aller Wells durch.
  • Sie können die Fluoreszenzamplitude einzelner Wells leicht höher oder niedriger als die NTCs festlegen, um eine Fehlklassifizierung einiger Partitionen zu vermeiden.
  • Obwohl kein Konsensuswert vorliegt, wird eine Reaktion normalerweise als positiv bewertet, wenn die Anzahl positiver Partitionen 2 überschreitet.
  • Verwenden Sie beim Umgang mit Variationen von Well zu Well und Charge zu Charge den Volumenpräzisionsfaktor (VPF), um das exakte Volumen jedes Wells zu definieren, und wenden Sie den Faktor bei Konzentrationsberechnungen durch Ihre Software an.
Beispiele für digitale PCR-Daten
Applikationshandbuch für die digitale PCR mit QIAcuity
Erhalten Sie eingehende Informationen über das Einrichten von Experimenten und das Durchführen der Datenanalyse für dPCR-Applikationen.

Digitale MIQE(dMIQE)-Richtlinien

Die Richtlinien für minimale Informationen für die Publikation von digitalen PCR-Experimenten (dMIQE), ursprünglich erstellt, um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit von qPCR-Ergebnissen sicherzustellen, wurden auch für das digitale PCR-Protokoll angepasst. Die Sammlung aus Richtlinien wird bei der Produktion und Publikation von dPCR-Daten verwendet und hat das Ziel, die dPCR-Herangehensweise zu harmonisieren und aussagekräftige Ergebnisse bereitzustellen, die von verschiedenen Laboren problemlos interpretiert werden können.

Die dMIQE-Richtlinien bieten eine Checkliste von Punkten für die Publikation der Ergebnisse von dPCR-Experimenten, damit die Methoden und Ergebnisse reproduziert, verfolgt und verstanden werden können. Die dMIQE-Richtlinien dienen dazu, um die Replikation von Experimenten zu erleichtern, und bieten kritische Informationen für die Analyse und Überprüfung der technischen Qualität der Arbeit, unabhängig von der eingesetzten dPCR-Technologie. 

Researchers optimizing dPCR assays and remaining compliant with dMIQE guidelines

Die Checklisten-Elemente der dMIQE-Richtlinien gelten bei der Publikation von dPCR-Ergebnissen als unerlässlich. Die Informationen, die berichtet werden müssen, umfassen u. a.:

  • Mittlere DNA-Target-Kopien je Partition (λ)
  • Anzahl verwendeter Partitionen (zusammen mit den mittleren DNA-Target-Kopien können diese Werte die Präzision des dPCR-Assays bestimmen)
  • Strukturinformationen zum Template, da die Art der Probe die Datengenauigkeit und -zuverlässigkeit beeinflussen könnte:
    • Template-Typ der einzelnen Partitionen: genomisch, Plasmid usw.
    • Quelle: Organismus, Gewebe, Zelle, Lebensmittel, Pflanze usw.
    • Behandlung: Restriktionsverdau, Ultraschallbehandlung, Präamplifikation, Verdünnung, keine
  • Volumen der einzelnen Partitionen, da dieses Volumen über dPCR-Plattformen variieren kann
  • Gesamtvolumen der Reaktion, welches durch Multiplikation der Anzahl Partitionen mit dem Partitionsvolumen berechnet werden kann
  • Arten der verwendeten Kontrollen
  • Repräsentative Amplifikationsplots oder Endpunkt-Fluoreszenzwerte der positiven und negativen experimentellen Daten
  • Beispielhafte experimentelle Varianz, vorzugsweise aus verschiedenen biologischen Replikaten, um die experimentelle Unsicherheit genauer erfassen zu können
  • Andere
Whitepaper: Verstehen des Totvolumens und Umgang damit
Das Totvolumen ist ein wichtiger Parameter in den iMIQE-Richtlinien. Erfahren Sie mehr darüber, wie die Einschränkungen des Totvolumens überwunden werden können, um eine hohe dPCR-Sensitivität zu erreichen. 

Vorgehen beim Übertragen und Optimieren von Assays von der qPCR zur dPCR

Die Überlegungen für das Design von Real-time PCR-Assays gelten auch für ein digitales PCR-Protokoll. Ein Assay, der zufriedenstellende qPCR-Ergebnisse generiert, wird auch mit dPCR erfolgreich sein. Es ist trotzdem empfehlenswert, zunächst die Konzentrationen einer validierten qPCR-Methode zu verwenden, aber einen Primer-/Sonden-Konzentrationsgradienten durchzuführen, wenn die Endpunktfluoreszenzwerte der positiven Partitionen verbesserungsbedürftig sind. Wie in den obigen Abschnitten beschrieben, sind auch die Kompatibilität der Fluorophore sowie die empfohlenen Bedingungen für das Thermocycling und die Primer-/Sondenkonzentrationen für die dPCR zu beachten.
Parameter für die Optimierung von dPCR-Assays
Bedingung Variabler Effekt auf Bereich
Annealing-Temperatur •Spezifität
•Trennung positiver und negativer Partitionen
•Assay-Artefakte
•Theoretische oder Arbeits-Ta +/‑ 2,5 ºC
Primer-/Sondenkonzentration •Trennung positiver und negativer Partitionen
(Erhöhung des positiven oder Reduzierung des negativen Signals)
•0,8 µm Primer; 0,4 µm Sonde (Startpunkt)
Thermocycling-Schritte •Beseitigung des intermediären Partitionssignals •2 oder 3 (Einschluss der Elongation bei 72 ºC)
Anzahl Thermocycling-Wiederholungen •Beseitigung des intermediären Partitionssignals •30–60 Wiederholungen

Bei Einrichtung eines neuen Assays empfiehlt sich jedoch immer ein anfänglicher Pilottest, um die Leistung zu beurteilen. Es ist auch anzuraten, gut charakterisierte und repräsentative Kontrollen in einer geeigneten Hintergrundmatrix zu verwenden. Der Assay sollte optimiert werden, um die analytische Genauigkeit sicherzustellen, wenn die Leistung suboptimal ist. In solchen Fällen müssen die Einzelheiten des Optimierungsprozesses unbedingt berichtet werden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Zur schnellen Optimierung suboptimaler Assays durch Ausführung eines Temperaturgradienten in den Annealing-Schritten können die QIAcuity Master-Mixe auch auf jedem beliebigen Real-time PCR-Gerät analysiert werden.

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Betrachten Sie Vergleichsdaten zur Leistung von qPCR und dPCR, um eine fundierte Entscheidung zu treffen, welche Methode sich für Ihre Applikation eignet.

Fehlerbehebung für die digitale PCR

dPCR-Experimente können von ähnlichen Problemen betroffen sein wie qPCR oder traditionelle oder herkömmliche PCR. Allerdings gibt es einige spezifische Herausforderungen, die bei der Durchführung eines digitalen PCR-Assays auftreten könnten. Die nachstehende Tabelle dient als Ratgeber für die Fehlerbehebung bei der dPCR. Häufig auftretende Probleme in einem typischen dPCR-Protokoll werden zusammen mit möglichen Ursachen und Empfehlungen von Experten beschrieben.

Problem Mögliche Ursachen Unsere Empfehlungen
Keine negativen Partitionen Falls NTC-Wells negative Partitionen aufweisen: Die
Target-Konzentration in der Probe ist zu hoch
Verdünnungsreihe durchführen, um die optimale Menge eingesetzter DNA zu bestimmen
Falls NTC-Wells nur positive Partitionen aufweisen:
Sondenhydrolyse aufgrund schlechter langfristiger
Lagerung der Sonden-Stammlösung oder vorzeitige
Sondenspaltung durch die Polymerase
Sonde nachbestellen und neue Sonden-Stammlösung herstellen oder
assayinterne Interaktionen identifizieren, dPCR-Assaykomponenten neu designen,
um Bindung und Spaltung zu reduzieren
Keine positiven Partitionen Restriktionsenzym könnte
innerhalb der Target-Sequenz geschnitten haben
dPCR-Assay mit DNA, die mit einem anderen Enzym für den Restriktionsverdau
behandelt wurde, und unverdauter DNA testen
Die Target-Sequenz ist Teil einer Sekundärstruktur
oder enthält Loops, Wiederholungen,
einen hohen GC-Anteil
Für ein anderes Target neu designen; ein Restriktionsenzym
zur Fragmentierung der eingesetzten DNA verwenden (ohne in der Target-Sequenz selbst zu scheiden)
Die Amplifikationsbedingungen sind nicht optimal Gradienten der Annealing-/Elongationstemperatur durchführen, um
die optimale Temperatur für das digitale PCR-Protokoll zu bestimmen; physikalische
Parameter (Elongationszeit, An-/Abstiegszeit usw.) anpassen
Teilweise dPCR-Inhibition Methode/Kit für die Nukleinsäureaufreinigung ändern; Zugabe eines
Facilitators wie BSA in Erwägung ziehen
Primer oder Sonden stimmen entgegen den Erwartungen nicht mit der Target-Region
überein
Sicherstellen, dass beim dPCR-Assaydesign oder der Synthese
der Primer/Sonden keine Fehler gemacht wurden
Positives Signal aus NTC-Wells Template-/Amplifikatkontamination
in den Reagenzien
Pipetten, Pipettenspitzenboxen und Arbeitsflächen mit 5–10%iger Bleiche abwischen;
Probenvorbereitung in einem anderen Raum durchführen als die dPCR; geeignete
persönliche Schutzausrüstung tragen; dUTP-haltige Gemische
könnten zusammen mit hitzeinstabiler Uracil-N-Glycosylase(UNG) die Anzahl
falsch Positiver aufgrund kontaminierender PCR-Produkte reduzieren,
haben aber keinen Effekt bei auf das Template zurückzuführenden Kontaminanten
Niedrige Anzahl Positiver Schlechte DNA-Aufreinigung Nur aufgereinigte DNA verwenden; alternative Methode oder anderes Aufreinigungskit ausprobieren
Nicht ordnungsgemäße Proben- oder Nanoplattenbeladung Weder zu viel noch zu wenig DNA laden; vorsichtig pipettieren und sicherstellen, dass das
gesamte dPCR-Gemisch in die Nanoplatte überführt wurde; sicherstellen, dass die Probe
am Boden der Eingabe-Wells bleibt
Falsche Primer-Konzentration Die empfohlenen Primer- und Sondenkonzentrationen verwenden
Verdampfung aus der Nanoplatte während der
Amplifikation
Nanoplatte sorgfältig (auch an den Kanten) mit einem Roller und Folie versiegeln
Luftblasen in Eingabe-Wells; Sorgfältig pipettieren; Nanoplatte beim Transport nur an den seitlichen
Kanten halten; Nanoplatte nicht fallen lassen und nicht umdrehen
Schütteln oder unsachgemäße Probenüberführung
in die Nanoplatte (sodass sich nicht die gesamte Probe
am Boden der Eingabe-Wells sammelt)
Keine klare Trennung zwischen
positiven und negativen Partitionen
Suboptimale Amplifikationsbedingungen Anzahl der Zyklen erhöhen (jedoch 50 Zyklen nicht überschreiten); An-/Abstiegsrate
senken (z. B. 2 °C/s); Elongationszeit auf 2 Minuten erhöhen,
Denaturierungszeit auf 1 Minute erhöhen (besonders wichtig bei längeren Amplifikaten);
Verdünnungsreihe durchführen, um die optimale Menge an Eingabe-DNA zu bestimmen
Unfähigkeit zur Trennung zwischen positiven und
negativen Partitionen beim Arbeiten
mit EvaGreen
Übermäßige Menge an Primer oder DNA-
Ausgangsmaterial
Primer in den empfohlenen Konzentrationen verwenden; nicht mit
Ausgangsmaterial überladen
Zu hohe Fragmentlänge Fragmentlänge durch Restriktionsverdau homogenisieren
Auftreten von Hintergrund-„Regen“
(Partitionen, die weder zur
positiven noch zur negativen Population gehören)
Unspezifische Bindung Nicht mit Primern überladen; versuchen, die Annealing-Temperatur zu erhöhen,
die Anzahl Zyklen zu reduzieren, Elongations- und Annealing-Zeit zu verkürzen;
sicherstellen, dass die Reagenzien frei von Verunreinigungen sind
Schlechte Target-Zugänglichkeit Mit Restriktionsverdau (Schneiden der Target-Sequenz vermeiden) oder
Ultraschallbehandlung arbeiten; zum Umgang mit RNA-Sekundärstrukturen versuchen, die Target-Position
zu ändern oder reverse Transkription bei höheren Temperaturen durchzuführen
Später PCR-Beginn aufgrund teilweiser Inhibition
einiger Partitionen
Menge der geladenen Probe reduzieren; Probe weiter verdünnen;
Methode oder Kit für die Nukleinsäureaufreinigung ändern
Auftreten von Rauschen (Cluster
negativer Punkte oberhalb des Schwellenwerts)
Feste Kontaminanten oder Luftblasen Beim Vorbereiten der Nanoplatte besonders vorsichtig vorgehen; Ergebnisse wenn möglich manuell überprüfen,
um sie besser zu verstehen
Optische Probleme mit dem Gerät Sicherstellen, dass das dPCR-System eine fortschrittliche Optik-Technologie mit hoher
Optik-Stabilität aufweist
Auftreten eines zusätzlichen unerwarteten
Clusters
Eine Sequenzvariante des Targets von
Interesse
Wenn das unerwartete Cluster unerwünscht ist: Schwellenwert oberhalb des Clusters platzieren,
um es aus der Quantifizierung auszuschließen, Annealing-Temperatur erhöhen, um die
Spezifität zu verbessern, mit Restriktionsenzym verdauen, um
unspezifische Targets zu schneiden, Primer oder Sonde neu designen, um die Komplementarität mit der
Off-Target-Sequenz zu reduzieren; wenn das Cluster ein potenzielles funktionales
Homolog repräsentiert, eine Senkung der Annealing-Temperatur in Erwägung ziehen, damit die beiden
Cluster zu einem verschmelzen
Keine Konzentrationsmessung
in einigen Wells
Problem mit der Zusammenstellung des
Reaktionsgemischs oder der Probenvorbereitung
Sicherstellen, dass der dPCR-Assay ordnungsgemäß eingerichtet ist und die DNA-Einsatzmenge und
-Reinheit ausreichend sind
Schlechte Handhabung der Nanoplatte beim
Transport (Schütteln, Fallenlassen)
Bei der Probenvorbereitung und dem Pipettieren des dPCR-Reaktionsgemischs
in die Nanoplatte besonders vorsichtig vorgehen, Nanoplatte nur an den seitlichen Kanten halten, Umdrehen,
Schütteln, Fallenlassen vor dem Laden in das dPCR-System vermeiden;
falls möglich in der Software manuell einen Schwellenwert zur Berechnung
einer bestimmten Konzentration festlegen
Unsachgemäße Plattenversiegelung
(Verdampfung an den Seiten)
Platte unter Zuhilfenahme eines Rollers sorgfältig mit Folie versiegeln
Gemessene Konzentrationen sind zu niedrig Schlechtes dPCR-Assaydesign Temperaturgradienten-Experiment durchführen, um sicherzustellen, dass der dPCR-Assay
bei optimalen Bedingungen ausgeführt wird; sicherstellen, dass das Fluorophor nicht
mit einem G-Rest konjugiert ist; Primer und Sonden in den empfohlenen Konzentrationen zugeben
Schlechte Target-Zugänglichkeit Mit Restriktionsverdau (Schneiden der Target-Sequenz vermeiden)
oder Ultraschallbehandlung arbeiten
Vorliegen von PCR-Inhibitoren in Proben Methode/Kit für die Nukleinsäureaufreinigung ändern; Facilitator
wie BSA zugeben
Große Fehlerbalken (uneinheitliche Ergebnisse) Schlechtes Mischen der Reaktionsgemische Reaktionsgemische gründlich mischen
Probleme mit der Temperatureinheitlichkeit
des Thermocyclers
Denaturierungstemperatur für die ersten fünf Zyklen von 94 auf 96 °C
erhöhen

Mehr Unterstützung bei der dPCR-Optimierung

Literatur

Iowa Institute of Human Genetics – Droplet Digital PCR (Zugriff am 20. January 2023)

Lindner L et al. Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies. Methods. 2021; 191(4):95-106.

Pecoraro S et al. Overview and recommendations for the application of digital PCR. EUR 29673 EN, Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2019

QIAGEN. QIAcuity User Manual Extension. June 2021.

Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 2012; 113(5):1014-1026.

Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS – mechanisms and solutions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2020; 412:2009-2023. 

The dMIQE Group and Hugget JF. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. 2020; Clin Chem 66(8):1012-1029.