Weil technologische Fortschritte die digitale PCR (dPCR) zunehmend verfügbar und erschwinglich machen, nimmt das Interesse daran stetig zu. Damit hat die dPCR das Potenzial, die Life-Science-Forschung ebenso wie klinische Applikationen bedeutend zu beeinflussen. Im Oktober 2019 haben wir ein Gäste-Webinar ausgerichtet, bei dem die Leitlinien zur Nutzung dieser vielversprechenden Technologie besprochen wurden.
Dabei haben die Teilnehmer unseres Webinars viele interessante Fragen aufgeworfen. Hier finden Sie eine Zusammenstellung unserer 20 häufigsten Fragen nebst hilfreicher Antworten unseres Gastredners.
Um sich die Aufzeichnung dieses Webinars sowie der Diskussion im Anschluss an das Webinar anzuhören, klicken Sie auf den nachstehenden Link.
“Tipps und Tricks für eine genauere digitale PCR”, präsentiert von Dr. Mikael Kubista, TATAA Biocenter AB and Department of Biotechnology, CAS
Aufgezeichnete Webinar-Sitzung – hier ansehen
In diesem Experten-Webinar teilte Dr. Kubista seine Erfahrung mit der Entwicklung von Applikationen und Bereitstellung von Dienstleistungen auf dem Gebiet der digitalen PCR, die er in seinen fast 12 Jahren am TATAA Biocenter gesammelt hat. Er und sein Team haben all die Probleme bewältigt, die bei der dPCR-Analyseworkflows häufig auftreten, und robuste Standardarbeitsanweisungen zur Minimierung des Fehlerrisikos und Maximierung der Robustheit und Wiederholpräzision erarbeitet. Sie haben verschiedene Kontrollen zum Testen der Leistung und Validierung der Methoden entwickelt. Er hat auch seine Tipps und Tricks für Design und Validierung von dPCR-Assays geteilt, mit dem Schwerpunkt auf Strategien für die Kopienzahlbestimmung und den Nachweis seltener Mutationen.
Frage-Antwort-Runde nach dem Webinar:
Die Berechnung von 1,6 Kopien/Partition und 80 % Sättigung basierte auf 10.000 Partitionen. Was ändert sich, wenn die Anzahl der Partitionen zunimmt?
Es ändert sich nichts. 1,6 Kopien pro Partition, die einer 80%igen Sättigung entsprechen, sind unabhängig von der Anzahl der Partitionen eine optimale Bedingung im Hinblick auf Präzision. Die Ungenauigkeit (Fehler) nimmt mit zunehmender Anzahl der Partitionen jedoch im Allgemeinen ab.
Ist es möglich, bei Erhöhung der Anzahl der Partitionen ein einzelnes Molekül nachzuweisen, statt LOD = 3?
Angenommen, der Assay verläuft gut und die PCR amplifiziert ein einzelnes Molekül, sodass es nachweisbar wird. Bei der LOD geht es nicht um den Nachweis eines Moleküls, wenn dieses vorliegt, sondern um die Wahrscheinlichkeit, dass ein Molekül auf den Chip geladen wird, da wir nur einen kleinen Anteil der Gesamtprobe (z. B. Patientenblut) analysieren. Die Probe muss mindestens 3 Target-Moleküle pro analysiertes Gesamtvolumen enthalten, damit die Analyse zu 95 % ein positives Ergebnis liefert. Wenn die Probe also 3 Targets pro analysiertem Volumen enthält und das Experiment 100-mal wiederholt wird, erwarten wir, dass 95 der Experimente positiv ausfallen, fünf hingegen negativ. Die LOD ist unabhängig von der Messtechnik; sie ist eine Folge der Ambiguität bei der Probennahme.
Wie oft werden bei der Validierung neuer Assays gegen ValidPrime bei Verwendung synthetischer Fragmente, die beide Target-Sequenzen enthalten, mit den beiden Assays unterschiedliche Konzentrationen gemessen?
Die Konzentrationen sind identisch, da sie Teil desselben Moleküls sind, aber ich nehme an, dass Sie wissen möchten, ob sich die gemessenen Mengen unterscheiden. Es ist wichtig, die Assays separat durchzuführen und jeden Assay einzeln zu optimieren, da sie ggf. unterschiedliche Laufbedingungen erfordern. Nach der Optimierung bestehen die meisten von uns intern entwickelten Assays die Validierung (d. h. gleiche Anzahl wie ValidPrime).
Verbessert sich die Genauigkeit der absoluten Quantifizierung mit der tröpfchenbasierten dPCR?
Bei der Abschätzung der Konzentrationen von Testproben basierend auf einer Standardkurve ist die Unsicherheit von mehreren Faktoren abhängig. Die Messunsicherheit ist eine davon. Da die Reproduzierbarkeit bei der dPCR aufgrund der linearen Antwort höher als bei der qPCR ist, würde ich in der Theorie annehmen, dass dies der Fall ist. In der Praxis gehen den meisten Workflows vorgelagerte präanalytische Schritte voran, die störanfälliger sind als der Analyseschritt selbst. In diesem Fall gäbe es keinen Unterschied.
Ist es basierend auf den beschriebenen umfassenderen Multiplexierungsoptionen für die dPCR möglich, für alle dPCR-Plattformen halbe Sondenverdünnungen zu verwenden?
Ja, aber seien Sie sich bewusst, dass eine klonale Amplifikation erforderlich ist, welche sich leichter auf Plattformen mit einer großen Anzahl Partitionen realisieren lässt.
Kann die Primer-Effizienz die Auftrennung der Target-Sequenzen bei der Duplexierung von Ein-Farbstoff-Assays beeinflussen? Ich habe kürzlich den gleichen Farbstoff in einem Duplex-Assay verwendet, und die Targets konnten unterschieden werden, ohne auch nur die Primer-Konzentrationen zu variieren. Könnte das mit der Primer-Effizienz zu tun haben?
Angenommen, Sie sprechen von der Assay-Effizienz: Sie haben recht; Targets lassen sich anhand dieser Strategie unterscheiden. Wenn Primer unterschiedliche Tm oder Amplifikate aufweisen, erfordern unterschiedliche Längen unterschiedliche Elongationszeiten. Je nach Einstellung der Zyklusbedingungen können die Targets mit sehr unterschiedlichen Effizienzen amplifiziert werden. Die Targets können dann bequem über die Cq-Werte unterschieden werden. Dafür ist jedoch eine Detektion in Echtzeit erforderlich. Eine Unterscheidung ist auch mittels herkömmlicher Endpunkt-dPCR möglich, aber diese ist weit weniger robust.
Wie lässt sich mittels dPCR die DNA-Konzentration bestimmen?
Für Maus, Mensch und Ratte sind ValidPrime Assays verfügbar. Für andere Organismen müssen Sie Ihre Assays selbst konzipieren und validieren. Um das zu tun, entwirft man mehrere Assays, die auf Einzelkopie-Loci in der DNA von Interesse abzielen, und führt dann die dPCR durch. Wenn mehrere Assays die gleiche Anzahl ergeben, ist es vernünftig, anzunehmen, dass diese Assays in der Tat auf Einzelkopie-Loci abzielen und quantitativ sind. Weiterführende Informationen finden Sie hier: http://www.tataa.com/services/.
Können Sie Verfahren für die Validierung der dPCR im Hinblick auf die Genauigkeit empfehlen?
Die Genauigkeit erfordert einen Vergleich mit entweder einer Standard- oder einer Referenzmethode. Für menschliche genomische DNA bietet sich ein Vergleich mit SRM 2372a oder einem gegen SRM 2372a kalibrierten sekundären Standard an.
Wie lang ist die ValidPrime Target-Sequenz?
Die menschliche ValidPrime Target-Sequenz ist 143 bp lang und der Assay wurde umfassend charakterisiert.
Wie lässt sich beweisen, dass keine unvollständigen Nebenprodukte der chemischen Synthese des Standards vorhanden sind?
Gar nicht. Man misst die Menge an (einigermaßen) intaktem Standard mithilfe es ValidPrime Assays.
Müssen wir unsere Reagenzien reinigen?
Das ist abhängig von der Studie. Für Messungen von Kopienzahlvariationen (CNV) ist davon auszugehen, dass Kontaminationen durch menschlich gDNA in den Reagenzien vernachlässigbar sind; bei der Quantifizierung von Mitochondrien in Zellen können sie hingegen wichtig und bei der Analyse antiker DNA sogar kritisch sein.
Der EvaGreen-basierte Nachweis eines Targets ist in der Regel „chaotischer“ als sondenbasierte Assays. Wie lassen sich EvaGreen-Assays verbessern?
EvaGreen bindet unspezifisch an alle vorliegende dsDNA, sodass der Hintergrund von der Fragmentlänge im Tröpfchen abhängig ist. In der Regel lässt sich der Hintergrund durch Homogenisierung der Fragmentlänge, vorzugsweise mittels Restriktionsspaltung (damit nicht ihre Target-Sequenz zerschnitten wird) oder Ultraschallbehandlung, reduzieren. Sie können auch versuchen, den Hintergrund zu reduzieren, indem Sie die Gesamtmenge an geladener DNA verringern.
Ist die Leistung aller dPCR-Geräte vergleichbar oder sind einige besser als andere?
Die Leistung verschiedener dPCR-Geräte unterscheidet sich, da sie unterschiedliche Merkmale aufweisen, z. B. Anzahl der Partitionen, Kanäle, Detektion in Echtzeit, mehrere Readouts, offene/geschlossene Systeme usw. Dies spiegelt sich im Preis des jeweiligen Geräts wieder. Welches für Sie am besten ist, hängt von Ihren Anforderungen ab. Ziehen Sie eine Teilnahme am TATAA dPCR-Kurs in Betracht, in dessen Rahmen Sie die Gelegenheit haben, alle führenden Plattformen auszuprobieren, um eine informierte Entscheidung zu treffen.
Ich verwende ddPCR in der Molekulardiagnostik zum Nachweis von Pathogenen in der Umwelt. Inwieweit kann ich ddPCR zur Kalibrierung meiner qPCR-Assays einsetzen?
Eine Kalibrierung ist zuverlässig, wenn die Assay-Bedingungen die gleichen sind (gleiches Protokoll und gleiche Reagenzien). Allerdings sind Inhibitionen in Umweltproben häufig und sollten getestet werden. Dies erfolgt mithilfe eines Spike.
Hinsichtlich des Vergleichs der Sensitivität zwischen qPCR und dPCR. Das in das Gerät geladene Probenvolumen entscheidet über die Bestimmungsgrenze, korrekt? Welches Probenvolumen wird normalerweise für dPCR-Geräte eingesetzt, und welches für qPCR?
Unter Bedingungen, bei denen das Probennahme-Rauschen (Poisson-Verteilung) dominant ist, wird das analysierte Gesamtvolumen zum limitierenden Faktor für die Quantifizierung. Bei der qPCR unterliegt das analysierte Volumen beträchtlichen Variationen. Das Reaktionsvolumen des BioMark IFC (Fluidigm) liegt bei nur ca. 10 nl, und es gibt keine Genauigkeit, es sei denn, die Probe wird zur Steigerung der Konzentration voramplifiziert. Der aAmp (AlphaHelix) dagegen verwendet Superkonvektion, um 100 µl zu analysieren. Bei der dPCR lässt sich das Gesamtvolumen durch Analyse mehrerer Unter-Arrays oder mehrerer Chips kontrollieren. Die Tröpfchengröße des QX200 liegt beispielsweise bei 0,85 nl, was bei 20.000 Tröpfchen ein analysiertes Gesamtvolumen von 17 µl bedeutet.
Würde sich die dPCR für Qualitätskontrollapplikationen unter Einsatz von SNPs eignen? (Wäre sie z. B. in der Lage, die Konzentration eines seltenen Allels im 0,1-%-Bereich präzise abzuschätzen?)
Ja, in der Tat. Dies ist eine der beliebtesten Applikationen. Die Assays müssen trotzdem spezifisch sein, um falsch Positive in Partitionen zu vermeiden, die mehrere Wildtypmoleküle enthalten.
Welche Software sollte zum Design von Sonden für die dPCR verwendet werden?
Das Assay-Design für die dPCR unterscheidet sich nicht von dem für die qPCR. Verwenden Sie Ihre Standard-Pipeline für das Assay-Design.
Was ist die maximale DNA-Größe für die Eva/SYBR ddPCR?
Längere Amplifikate werden bevorzugt, da sie eine stärkere Fluoreszenz verursachen. Es gibt keine Obergrenze, sofern die Elongationszeit ausreicht, um das Template zu kopieren. Es gibt keine Probleme mit Sekundärstrukturen. 100–250 bp sind eine vernünftige Länge, die angestrebt werden sollte.
Könnten Sie die Multiplexierung unter Einsatz verschiedener Primer-Konzentrationen in einer einzelnen Reaktion noch etwas ausführlicher erläutern? Ist eine Unterscheidung nur mit dem Gerät allein problemlos möglich, oder werden zur Ergebnisanalyse noch weitere Tools benötigt?
Bei gut designten und validierten Assays, klonaler Amplifikation und unkomplizierten Proben sollte eine Unterscheidung in der Standard-Gerätesoftware möglich sein. Es ist jedoch ein komplexes, noch zu optimierendes System, und wird bevorzugen beim Multiplexing die Verwendung von Sonden.
Können ValidPrime Assays oder Referenz-Assays für bakterielle Prozesse verwendet werden? Können bakterielle Targets validiert werden?
Der standardmäßige ValidPrime Assay kann zur Validierung neu konzipierter Assays für jedes beliebige Target verwendet werden, da die Validierung am synthetischen Template erfolgt. Um als endogene Referenz verwendet werden zu können, muss der ValidPrime Assay jedoch auf den Stamm abzielen. TATAA bietet nur eine begrenzte Zahl an validierten, artenspezifischen ValidPrime Assays an, aber in der Literatur lassen sich weitere von Forschungsgruppen entwickelte Assays finden. Diese sind vielleicht nicht ausgiebig validiert, könnten für Ihre Zwecke aber durchaus ausreichend sein.