A veces, los científicos que se dedican a la biología molecular y la investigación genómica que implica la cuantificación de ácidos nucleicos se enfrentan a decisiones difíciles. ¿Qué técnica de cuantificación debe utilizarse para alcanzar los objetivos de investigación de manera eficiente? ¿La PCR digital (dPCR) más precisa y sólida, o una real-time PCR cuantitativa (qPCR) más estandarizada y con la que el equipo está acostumbrado a trabajar? La elección depende de las aplicaciones. Para las mentes curiosas, en este artículo se proporciona información sobre la evolución técnica y las aplicaciones prácticas de estas dos generaciones de técnicas de PCR.
Desde el descubrimiento de las qPCR en 1993, los investigadores valoran mucho esta técnica por su velocidad, su sensibilidad, su especificidad y su facilidad de uso. La técnica se usa fundamentalmente para llevar a cabo experimentos de expresiones genéticas, detección de SNP, genotipado o discriminación alélica, y para validar datos de micromatrices. Los ensayos de qPCR cuidadosamente diseñados pueden detectar varias copias de la secuencia de un elemento diana por reacción, lo que permite un amplio rango de cuantificación dinámica. Se puede escoger entre la química de detección, que va desde el intercalado de colorantes (SYBR Green) a las sondas específicas de elementos diana (TaqMan, balizas moleculares, etc.).1 El costo por muestra es muy flexible y se adapta al volumen de reacción, al rendimiento y al método de detección para cubrir las necesidades concretas de cada investigación. Además, la publicación de las guías de MIQE para qPCR impulsó la coherencia entre laboratorios y aumentó la reproducibilidad de los experimentos.2
Sin embargo, las qPCR flaqueaban en aplicaciones que requerían una mayor precisión y sensibilidad, como la detección de variaciones en el número de copias y eventos poco frecuentes. En aplicaciones de este tipo, las dPCR tenían un mejor rendimiento que las qPCR, ya que no solo medían el número total de copias, sino que también superaban los límites de detección, es decir, detectaban ligeras diferencias y dianas poco abundantes, o lo que es lo mismo, encontraban «la aguja en el pajar». Mediante las PCR digitales se eliminó la necesidad de recurrir a una curva estándar. También se demostró una susceptibilidad inferior a los inhibidores derivados de la lectura de fluorescencia convencional de las divisiones. Los índices de error se redujeron mediante la supresión del sesgo de eficiencia de las PCR, algo que la comunidad científica agradeció sin lugar a dudas.3
Irónicamente, aunque a principios de la década de 1990 surgió la emergencia de las «PCR de dilución limitada» o «PCR digitales», el avance de estas técnicas se frenó debido a las real-time PCR.4,5 ¿Por qué? Por falta de instrumentos y elementos químicos. Afortunadamente, el panorama actual es mucho más alentador en lo que respecta al futuro de esta tecnología.6 Las PCR digitales ofrecen un enfoque directo de «todo o nada» que, en combinación con las continuas mejoras tecnológicas y la publicación de las guías MIQE, hicieron que resurgiera el interés en explotar su potencial.7 Hoy en día, cada vez más científicos emplean las dPCR para estudiar las mutaciones genéticas del cáncer, supervisar la eficacia de la inmunoterapia, detectar microrganismos patógenos, analizar organismos modificados genéticamente, estudiar frecuencias de edición genética y realizar pruebas prenatales para detectar enfermedades genéticas, por lo que el área de aplicaciones se sigue expandiendo.8
2. Bustin S.A. et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data. Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: a brief history. Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: A technology review. Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments. Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.
Desde el descubrimiento de las qPCR en 1993, los investigadores valoran mucho esta técnica por su velocidad, su sensibilidad, su especificidad y su facilidad de uso. La técnica se usa fundamentalmente para llevar a cabo experimentos de expresiones genéticas, detección de SNP, genotipado o discriminación alélica, y para validar datos de micromatrices. Los ensayos de qPCR cuidadosamente diseñados pueden detectar varias copias de la secuencia de un elemento diana por reacción, lo que permite un amplio rango de cuantificación dinámica. Se puede escoger entre la química de detección, que va desde el intercalado de colorantes (SYBR Green) a las sondas específicas de elementos diana (TaqMan, balizas moleculares, etc.).1 El costo por muestra es muy flexible y se adapta al volumen de reacción, al rendimiento y al método de detección para cubrir las necesidades concretas de cada investigación. Además, la publicación de las guías de MIQE para qPCR impulsó la coherencia entre laboratorios y aumentó la reproducibilidad de los experimentos.2
Sin embargo, las qPCR flaqueaban en aplicaciones que requerían una mayor precisión y sensibilidad, como la detección de variaciones en el número de copias y eventos poco frecuentes. En aplicaciones de este tipo, las dPCR tenían un mejor rendimiento que las qPCR, ya que no solo medían el número total de copias, sino que también superaban los límites de detección, es decir, detectaban ligeras diferencias y dianas poco abundantes, o lo que es lo mismo, encontraban «la aguja en el pajar». Mediante las PCR digitales se eliminó la necesidad de recurrir a una curva estándar. También se demostró una susceptibilidad inferior a los inhibidores derivados de la lectura de fluorescencia convencional de las divisiones. Los índices de error se redujeron mediante la supresión del sesgo de eficiencia de las PCR, algo que la comunidad científica agradeció sin lugar a dudas.3
Irónicamente, aunque a principios de la década de 1990 surgió la emergencia de las «PCR de dilución limitada» o «PCR digitales», el avance de estas técnicas se frenó debido a las real-time PCR.4,5 ¿Por qué? Por falta de instrumentos y elementos químicos. Afortunadamente, el panorama actual es mucho más alentador en lo que respecta al futuro de esta tecnología.6 Las PCR digitales ofrecen un enfoque directo de «todo o nada» que, en combinación con las continuas mejoras tecnológicas y la publicación de las guías MIQE, hicieron que resurgiera el interés en explotar su potencial.7 Hoy en día, cada vez más científicos emplean las dPCR para estudiar las mutaciones genéticas del cáncer, supervisar la eficacia de la inmunoterapia, detectar microrganismos patógenos, analizar organismos modificados genéticamente, estudiar frecuencias de edición genética y realizar pruebas prenatales para detectar enfermedades genéticas, por lo que el área de aplicaciones se sigue expandiendo.8
Mirar hacia adelante
Las tecnología de PCR, tanto en tiempo real como en digital, prometen un enorme crecimiento en el futuro. Aunque las qPCR se consideran un método fiable estándar en los laboratorios, las dPCR ofrecen numerosas ventajas de sensibilidad, precisión, fiabilidad y reproducibilidad que ayudarán a los científicos a ampliar sus conocimientos y llevarlos más allá. Gracias a la introducción de la innovadora tecnología de PCR digital basada en nanoplacas, los laboratorios que se están planteando pasar a los procesos digitales obtendrán muchas ventajas gracias al multiplexado y al mejor rendimiento. Tanto las grandes empresas como las universidades deben adaptarse a este entorno competitivo y encontrar el equilibrio perfecto en un mundo en constante cambio como es el de las PCR.Referencias
1. Deepak S.A. et al. Real-Time PCR: Revolutionizing detection and expression analysis of genes. Curr. Genom. 2007;8:234–251.2. Bustin S.A. et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data. Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: a brief history. Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: A technology review. Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments. Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.