PCR y amplificación del ADN

La ADN Taq polimerasa pertenece a la familia A de las polimerasas, un grupo de enzimas relacionadas que comprende las polimerasas de reparación bacterianas y la mayoría de las polimerasas replicativas de bacteriófagos. Las polimerasas de la familia A suelen tener actividades tanto replicativas como reparadoras. La actividad de la exonucleasa 3’→5’ proporciona la importante función de “corrección de pruebas”, que permite la reparación de un nucleótido mal emparejado, mientras que la actividad de la exonucleasa 5’→3’ permite la eliminación de los cebadores de ARN. En la Taq polimerasa, el dominio de corrección de pruebas de la exonucleasa 3’→5’ se ha modificado y no es funcional.

La PCR impone a una polimerasa las mismas exigencias básicas que una célula a su sistema de replicación: fiabilidad, precisión o fidelidad, velocidad y procesividad. La precisión o fidelidad de la polimerasa se refiere a la incorporación de los nucleótidos correctos especificados por la hebra de molde. Las ADN polimerasas garantizan una replicación precisa mediante una serie de puntos de control molecular en el lugar de incorporación de nucleótidos. La Taq polimerasa estándar es bastante precisa, con una tasa de error total relativamente baja, pero carece de actividad de “corrección de pruebas” de la exonucleasa 3’→5’, lo que limita el tamaño efectivo posible del amplicón de la enzima. Taq funciona mejor, y es una enzima robusta y fácil de optimizar, cuando se amplifican fragmentos de ADN <2 kb. La enzima puede trabajar con fragmentos de hasta 3–4 kb, pero su eficacia disminuye rápidamente con amplicones de más de 3 kb.

La PCR de hot start se facilita mediante modificaciones de la ADN polimerasa que bloquean la amplificación al dejar inactiva la enzima hasta que se alcanza una temperatura más elevada. Entre los modificadores habituales se encuentran la interacción de anticuerpos, la modificación química y la tecnología de aptámeros. Cuando se alcanzan temperaturas de reacción permisivas durante el ciclo de PCR, el inhibidor se disocia de la polimerasa y comienza la polimerización.

Los anticuerpos anti ADN Taq polimerasa ligados a enzimas inactivan la enzima al ligarse y unirse a la polimerasa, impidiendo la amplificación temprana del ADN a temperaturas más bajas. Una vez alcanzada la temperatura óptima de hibridación, los anticuerpos comienzan a degradarse y disociarse, liberando la ADN polimerasa Taq en la reacción y permitiendo que comience el proceso de amplificación.

Las ADN Taq polimerasas modificadas químicamente tienen grupos bloqueantes termolábiles unidos a residuos de aminoácidos específicos. Estos se eliminan mediante un paso inicial de activación a alta temperatura en la reacción de PCR. De este modo, la ADN polimerasa Taq recupera toda su actividad y se puede proceder al ciclado de la PCR.
La PCR de hot start mediada por aptámeros se basa en la inhibición de la función de la ADN Taq polimerasa mediante la unión de aptámeros oligonucleotídicos. Los aptámeros se disocian de la enzima a una temperatura más baja que los grupos de bloqueo químicos termolábiles o los anticuerpos, eliminando así la necesidad de un paso de activación a alta temperatura y acelerando los protocolos de PCR. Además, la inhibición basada en aptámeros es totalmente reversible, de modo que la actividad de la ADN Taq polimerasa también se bloquea al final del ciclo térmico.