dPCR para principiantes

Evolución de las dPCR

Las preguntas que se plantean en las complejas tareas de investigación de la actualidad requieren un nivel de detalle de información superior al que proporcionan las tecnologías PCR convencionales. Las PCR digitales de tercera generación se acercan en gran medida a dicho nivel de detalle y representan una técnica mucho más práctica y sencilla de enfrentarse a estas cuestiones.

El concepto de PCR digital surgió en 1992, cuando Skyes et al. lo definieron como «PCR de dilución limitante». Este método genérico utilizaba el análisis convencional y las estadísticas de Poisson para cuantificar el número absoluto de moléculas de ácido nucleico presentes en cada muestra. Posteriormente, llegó la labor revolucionaria de Vogelstein y Kinzler en 1999, quienes desarrollaron un método en el que la muestra se diluía y se distribuía en reacciones individuales, denominadas «particiones», y se detectaban y analizaban productos individuales con señales fluorescentes tras la amplificación. Ellos fueron quienes acuñaron el término «PCR digital» tal y como lo conocemos en la actualidad.

A lo largo de los años, estos métodos se han innovado y comercializado hasta alcanzar un uso generalizado. Se pueden realizar PCR digitales en discos y chips de microfluidos, micromatrices, microgotículas, microcristales basados en emulsiones de agua y aceite, y, desde hace poco, en placas similares a las de las qPCR.

Las PCR digitales son un enfoque muy preciso para la detección y cuantificación del ácido nucleico de forma reproducible y sensible. Para llevar a cabo las mediciones, la muestra se divide en particiones, de forma que en cada una de ellas haya cero, una o varias moléculas diana presentes en cada reacción individual. Cada partición es analizada después de un ciclado de PCR en punto final para detectar la presencia (reacción positiva) o ausencia (reacción negativa) de una señal de fluorescencia. Igualmente, se calcula el número absoluto de moléculas presente en la muestra. La cuantificación de elementos diana en la muestra mediante este tipo de PCR no depende de la curva estándar. Debido a que los resultados no dependen de la curva estándar, se reduce el error y se incrementa la precisión.

Divida y vencerá

Aunque la muestra se prepara de manera similar a las muestras para qPCR, la división de la muestra, en la que se divide en miles de reacciones individuales antes de la amplificación, es un paso exclusivo de las PCR digitales. Mediante la distribución aleatoria de las moléculas en particiones, a diferencia de los análisis en bloque de las qPCR, las PCR digitales minimizan el efecto de las moléculas diana que compiten entre sí y mejoran la precisión y la sensibilidad en la detección de moléculas poco frecuentes.

Esta opción permite a los investigadores:

• Cuantificar moléculas diana de baja abundancia o en señales de fondo complejas
• Detectar y diferenciar variantes alélicas (SNP)
• Supervisar pequeños cambios en los niveles de moléculas diana que no pueden detectarse mediante qPCR

La ecuación de Poisson da sentido al método de división

Al contrario de lo que ocurre con las qPCR en tiempo real, las PCR digitales no dependen de cada ciclo de amplificación para determinar la cantidad relativa de moléculas diana. Más bien, funcionan mediante las estadísticas de la ecuación de Poisson para determinar la cantidad de moléculas diana absolutas tras la amplificación convencional.

Debido a que la molécula diana está distribuida al azar en las distintas partes disponibles, la distribución según la ecuación de Poisson calcula el número de moléculas medio de cada partición (cero, una o varias) y calcula las copias de la molécula diana por cada partición positiva. El análisis estadístico de Poisson del número de reacciones positivas y negativas da lugar a una cuantificación precisa y absoluta de la secuencia de la diana.