Clonación y recombinación de ADN

Saliente o romo: modificación, hibridación y ligadura

Las tecnologías de clonación y recombinación de ADN han aportado muchos conocimientos sobre los mecanismos de los genes y las células, tanto en la salud como en la enfermedad. En la actualidad, las técnicas y aplicaciones de clonación continúan avanzado con aplicaciones innovadoras como el ensamblaje de alto rendimiento de bibliotecas combinatoriales y mapeo de modificaciones epigenéticas.

Enzimas para clonación

Es posible que se requiera una modificación terminal de los extremos antes de que se pueda clonar el ADN del molde en un vector plásmido adecuado. Por lo general, el ADN identificado para la clonación se aísla de la fuente mediante digestión enzimática de restricción o la amplificación por PCR. Las enzimas especializadas como Klenow Fragment, T4 DNA polymerase y T4 polynucleotide kinase modifican los extremos de 3’ o 5’ para mejorar la unión covalente entre los fragmentos de ADN y el vector.

El paso siguiente de la clonación es la ligadura con una enzima adecuada para hibridar los extremos del vector y el inserto.

La adición suele realizarse en la preparación de un vector-T para utilizarlo en la clonación de TA o para añadir una secuencia de “A” a un producto de PCR producido por una polimerasa de alta fidelidad (no Taq) para su uso en la clonación de TA. Los productos de amplificación con ADN polimerasa Taq ya tienen una secuencia de “A”.

Enzimas para la modificación terminal de ADN

Enzimas para ligadura de ADN

Enzyme	Ligation
	Ligation of sticky cohesive ends	Ligation of blunt ends	Nick sealing
EN11 T4 DNA Ligase BLIRT	✔ Yes	✔ Yes	✔ Yes
EN13 Tth DNA Ligase*	✔ Yes	✘ No	✔ Yes

Es un método SLIC de clonación

La clonación independiente de secuencia y ligación (SLIC) aprovecha la actividad enzimática de la exonucleasa:

Clonación para secuenciación de última generación

Una librería destinada a la secuenciación de última generación comienza por el ADN fragmentado. La acción enzimática completa los pasos de clonación.

icon-genomicsFragmentos romos
Los extremos se vuelven romos y se convierten en 5’ fosforilados con las enzimas T4 DNA polymerase, Klenow Fragment y T4 PNK.
icon-bio-informaticsAñada “A” en los extremos.
A continuación, a los extremos 3’ se les añade una secuencia de “A” mediante una de estas dos enzimas: ADN polimerasa Taq o Klenow Fragment (3’→5’ exo-).
icon-barcodeAdición de adaptadores
A continuación, se añaden los adaptadores o códigos de barras complementarios mediante ligadura con la enzima final, T4 DNA ligase.

Todos los componentes enzimáticos necesarios para la construcción de librerías de ADN pueden ensamblarse con adaptadores en un kit de preparación de librerías “propio”.

Síntesis génica

La síntesis génica se basa en la unión de oligodeoxinucleotidos que presentan extensas zonas de superposición complementaria.

icon-temperatureTaq DNA ligasa termoestable
Mejore la síntesis mediante el uso de Taq DNA ligasa termoestable en lugar de T4 DNA ligasa.

Las temperaturas de ligación más elevadas aumentan la probabilidad de formar productos de ligación correctos.
icon-targetLigasa selectiva de muescas

Use una ligasa selectiva ante muescas para evitar deleciones causadas por ligaduras entre espacios.

Los ADN de síntesis larga no se unen de forma desordenada.

Descubra las enzimas destacadas para la clonación y la recombinación de ADN

Preguntas frecuentes sobre enzimas para clonación y recombinación

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