Cómo escoger entre dPCR y qPCR – Descubra las ventajas y decida si la solución es adecuada para alcanzar los objetivos de su proyecto de investigación
Al comparar las tecnologías de dPCR y qPCR, la diferencia clave es el poder de decisión. Aunque algunas ofrecen una capacidad de cuantificación y detección de ácido nucleico fiable, la diferencia clave entre las dos tecnologías se puede comparar a las diferencias que existen entre una radio analógica y una digital, como afirma el Dr. Jim Huggett, Principal Scientist del National Measurement Laboratory. «En una radio analógica, el dial tiene que sintonizarse con mucha precisión para dar con el canal deseado con interferencias mínimas. Aun así, la calidad depende de la recepción y la señal puede sufrir interferencia de la estática. Esto es qPCR. Es fiable, pero para conseguir un resultado óptimo, requiere una optimización y, aun así, hay que lidiar con el ruido de fondo. Con la radio digital, simplemente llama a la estación y está allí, con una señal clara o no. Este último ejemplo correspondería a la dPCR, que proporciona resultados precisos y binarios. Su funcionamiento se basa, literalmente, en hacer recuentos de la presencia o ausencia de las moléculas de ADN. La claridad de los resultados, en combinación con una bajísima tasa de error, lo convierte en una solución con un altísimo nivel de precisión. La PCR digital es perfecta para medir diferencias cuantitativas más pequeñas».
Diferencias y similitudes entre qPCR y dPCR
| PCR en tiempo Real/qPCR | PCR digital |
|---|---|
| Cuantitativa, relativa o absoluta, pero requiere muestras de referencia o curvas estándar |
Cuantitativa y absoluta, no requiere estándares ni referencias |
|
PCR en bloque
|
Partición de muestra
|
| Mide la amplificación de PCR en cada ciclo | Mide al final de cada ciclo de PCR |
| Detecta índices de mutación >1 % | Detecta índices de mutación ≥0,1% (relación señal-ruido elevada) |
| Protocolos bien establecidos | Mayor precisión para una reproducibilidad superior entre laboratorios |
¿Cuándo optar por dPCR en lugar de qPCR?
A veces, los científicos que se dedican a la biología molecular y la investigación genómica que implica la cuantificación de ácidos nucleicos se enfrentan a decisiones difíciles. ¿Qué técnica de cuantificación debe utilizarse para alcanzar los objetivos de investigación de manera eficiente? ¿La PCR digital (dPCR) más precisa y robusta, o una PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) más estandarizada y con la que el equipo está habituado a trabajar? Ambas tecnologías tienen similitudes, ventajas y limitaciones, por lo que la elección de una u otra solución depende de la aplicación.
El cuadro de aplicaciones indica el nivel de idoneidad de cada tecnología para algunas de las aplicaciones más habituales.
La PCR digital por gotículas (ddPCR), una de las primeras formas de PCR digital, ya podía ofrecer ventajas respecto de la qPCR en la mayoría de las aplicaciones anteriores. En ddPCR frente a qPCR, la qPCR es adecuada para las aplicaciones que requieren un amplio intervalo dinámico, mientras que la ddPCR sirve para aplicaciones que requieren mayor precisión o el análisis de abundancia fraccional.
La evolución de ddPCR a dPCR basada en nanoplacas ha ampliado el alcance de esta tecnología para incluir más aplicaciones. El flujo de trabajo de la dPCR basada en nanoplacas es sustancialmente más rápido gracias a la lectura simultánea de todas las divisiones de la muestra, la automatización de las fases iniciales y una fácil configuración de placa similar a la de la qPCR. Esta velocidad añadida la hace adecuada para las aplicaciones de detección y alta resolución sin comprometer la precisión, la exactitud y la sensibilidad.