Enzimas para ensayos y detección

La ADN polimerasa T7 por sí misma tiene una baja procesividad. Se disocia de un primer-template tras la incorporación de <15 nt. Tras la infección de E. coli, el fago T7 anexiona una proteína del huésped, la tiorredoxina, que sirve como factor de procesividad. La ADN polimerasa T7 y la tiorredoxina se unen en un complejo uno a uno y la unión de la tioredoxina a la ADN polimerasa T7 aumenta en 80 veces la afinidad de la polimerasa específicamente a un cebador de molde. Una consecuencia de la mayor afinidad por un primer–template es la capacidad de la ADN polimerasa T7 para extender un primer en ADN monocatenario a lo largo de miles de nucleótidos sin disociarse, lo que permite la síntesis continua de largos tramos de ADN. La ADN polimerasa T7 puede utilizarse para la purificación de ADN circular cerrado covalentemente mediante la eliminación del ADN genómico residual y para sintetizar hebras complementarias de ADNc. 

Otra aplicación es la detección in-situ de ADN fragmentado por apoptosis mediante el marcado de muescas presentes en el ADN de doble cadena. La alta procesividad, la fuerte actividad exonucleasa 3’→5’ y la capacidad de tolerar varios nucleósidos trifosfatos marcados son las propiedades más importantes para la aplicación de la ADN polimerasa T7 en el marcaje in situ de daños en el ADN.

El ensayo cometa in vivo es una prueba de genotoxicidad establecida, con una directriz de ensayo de la OCDE. En su forma estándar, detecta daños en el ADN en forma de rupturas de hebra y sitios álcali-lábiles. La inclusión de un paso adicional en el ensayo, en el que el ADN se incuba con una enzima específica de la lesión, puede proporcionar información importante sobre la naturaleza específica del daño en el ADN.

La mayoría de las aplicaciones del ensayo de reparación son en biomonitorización humana. Cada día, la población humana está expuesta a compuestos mutágenos y cancerígenos, tanto laborales como ambientales. En cuanto a la exposición ocupacional, varios trabajadores están expuestos a compuestos genotóxicos/mutagénicos, por ejemplo: pesticidas, tintes para el cabello, formaldehído, agentes antineoplásicos, disolventes orgánicos, etc.

La técnica del ensayo cometa se basa en la electroforesis de nucleoides individuales (ADN unido a la matriz nuclear tras la lisis celular y la eliminación de las histonas), lo que da lugar a una imagen similar a la de un cometa en la que la intensidad de la cola depende de la frecuencia de las roturas que relajan el superenrollamiento y permiten la migración de los bucles de ADN que contienen las roturas. La digestión de los nucleoides con endonucleasas específicas de lesión permite detectar diferentes lesiones del ADN.

Endonuclease VIII (Endo VIII) de E. coli es responsable de la eliminación de una amplia gama de bases de pirimidina oxidativamente dañadas, incluidos los productos de radiólisis de la timina, como el timina glicol y la urea. La enzima se utiliza en el ensayo cometa para indicar esta clase de daños en el ADN. La Endo VIII opera en la vía de reparación por escisión de bases (base excision repair, BER) y cataliza la hidrólisis del enlace N-glicosídico (actividad N-glicosilasa). Como resultado, se forman la base libre modificada y el sitio apurínico/apirimidínico (AP). La posterior escisión del sitio AP se produce mediante la eliminación de β y δ (actividad AP-liasa) y produce una rotura de ADN monocatenario. El ensayo detecta la ruptura y se identifica la lesión.

El análisis de la huella de DNase I de Endo VIII muestra la unión de la proteína al ADN como una pequeña huella con sitios de contacto principalmente en la hebra que contiene el daño.