El interés por las PCR digitales (dPCR) aumenta a medida que los avances tecnológicos hacen que sean cada vez más accesibles y asequibles. Por ello, las dPCR tienen la capacidad de influir significativamente en las investigaciones de ciencias de la vida y en las aplicaciones clínicas. En octubre de 2019, celebramos un seminario web con invitados en el que se expusieron ciertas guías para sacar el máximo partido de esta prometedora tecnología.
Recopilamos muchas preguntas interesantes formuladas por las personas que asistieron al seminario. Lea una recopilación de las 20 preguntas más interesantes y respuestas muy útiles por parte de nuestro ponente invitado.
Para escuchar la grabación de este seminario web, así como el debate posterior, haga clic en el enlace que aparece a continuación.
“Tips and tricks for more accurate digital PCR”, presentado por el Dr. Mikael Kubista, TATAA Biocenter AB y departamento de Biotecnología, CAS
Grabación de la sesión de seminario web: ver aquí
En este seminario web, en el que participaron varios expertos, el Dr. Kubista comparte su experiencia en el desarrollo de aplicaciones y servicios con PCR digital durante más de 12 años en el TATAA Biocenter. Él y su equipo han superado todos los problemas habituales de los flujos de trabajo analíticos de las dPCR y han desarrollado unos procedimientos operativos estándar muy sólidos para minimizar el riesgo de errores y maximizar la fiabilidad y la repetibilidad. Han desarrollado varios procedimientos de control para probar el rendimiento y validar la metodología. En el seminario también comparten consejos y recomendaciones para el diseño y la validación de los ensayos con dPCR, centrándose en las estrategias para la determinación del número de copias y la detección de mutaciones poco frecuentes.
Preguntas frecuentes tras el seminario web:
El cálculo de 1,6 copias por división y el 80 % de la saturación se basaba en 10.000 divisiones. ¿Cómo cambiaría si aumentara el número de divisiones?
No cambia. Con 1,6 copias por división correspondientes a una saturación del 80 %, tendríamos unas condiciones óptimas respecto a la precisión, independientemente del número de divisiones. Sin embargo, por lo general, la imprecisión (margen de error) disminuye cuanto mayor es el número de divisiones.
Si se incrementa el número de divisiones, ¿se puede detectar una única molécula en lugar de aplicar un límite de detección de LOD=3?
Partiendo de la base de que el ensayo está bien formulado, la PCR amplifica una molécula y, por tanto, posibilita su detección. El límite de detección no está relacionado con detectar una molécula si está presente, sino con la probabilidad de que una molécula se cargue en el chip, porque se analiza solo una pequeña fracción de la muestra total (por ejemplo, de la sangre del paciente). La muestra debe contener al menos 3 moléculas de la diana en el total del volumen analizado para que el análisis dé un resultado positivo con un 95 % de probabilidad. Por tanto, si una muestra contiene 3 dianas en el total del volumen analizado y el experimento se repite 100 veces, podemos esperar que 95 experimentos den un resultado positivo y 5, un resultado negativo. El LOD es independiente de la técnica de medición, es una consecuencia de la ambigüedad de los muestreos.
A la hora de validar nuevos ensayos, en comparación con ValidPrime, si se usan fragmentos sintéticos que contienen secuencias de ambas dianas, ¿con qué frecuencia se miden concentraciones distintas con los dos ensayos?
Las concentraciones son idénticas porque forman parte de la misma molécula, pero imagino que se refiere a si las cantidades medidas difieren. Es importante ejecutar el ensayo de PCR digital simple y optimizar cada ensayo individualmente, ya que podrían necesitar condiciones de ejecución distintas. Una vez optimizados, la mayoría de los ensayos que hemos diseñado internamente superan la validación (es decir, la misma cantidad que con ValidPrime).
¿La precisión de la cuantificación absoluta mejora con las PCR digitales basadas en gotículas?
A la hora de estimar las concentraciones de las muestras de prueba a partir de una curva estándar, la incertidumbre depende de varios factores y uno de ellos es la incertidumbre de medición. Debido a que la reproducibilidad es más elevada en las dPCR que en las qPCR, por la respuesta lineal, supondría que se trata de un caso así. En la práctica, la mayoría de los flujos de trabajo se someten previamente a procesos preanalíticos que pueden resultar más confusos que el análisis en sí, por lo que, en ese caso, no habría diferencias.
Según la explicación sobre las opciones de multiplexado alto en dPCR, ¿es posible usar diluciones de sondas en todas las plataformas de dPCR?
Sí, pero recuerde que necesita una amplificación clonal, que es más fácil de conseguir en plataformas con un mayor número de divisiones.
¿Podría la eficiencia del cebador influir en la separación de las secuencias de dianas en el momento del duplexado con un único ensayo con colorantes? Hace poco, he detectado que si empleo el mismo colorante en un ensayo duplexado, los elementos diana podían distinguirse sin que variaran las concentraciones del cebador. ¿Podría deberse a un problema por la eficiencia del cebador?
Suponiendo que se refiere a la eficiencia del ensayo, es correcto que las dianas pueden distinguirse mediante esta estrategia. Si los cebadores tienen distintos amplicones o niveles de Tm, las distintas longitudes requieren distintos tiempos de alargamiento; se pueden definir condiciones de ciclado que amplifiquen las dianas con resultados más o menos eficientes. Las dianas pueden distinguirse fácilmente según el valor del Cq. Sin embargo, para ello se requiere una detección en tiempo real. También pueden distinguirse mediante PCR digital convencional, pero es un método menos sólido.
¿Cómo se cuantifica la concentración de ADN a partir de una PCR digital?
En el caso de los organismos de ratón, humano y rata, pueden usarse los ensayos ValidPrime. En el caso de los otros organismos, deberá diseñar y validar sus propios ensayos. Para ello, deberá diseñar varios ensayos que se dirijan a los locus de una única copia del ADN de su interés y ejecutar la dPCR. Si hay varios ensayos que proporcionan el mismo recuento, se puede asumir que dichos ensayos se dirigen al mismo locus de copia única y son cuantitativos. Puede obtener más información aquí: http://www.tataa.com/services/.
¿Puede recomendar algún procedimiento en los procesos de validación de dPCR para garantizar la mayor precisión?
Para obtener resultados precisos, es imprescindible llevar a cabo una comparación con un estándar o un método de referencia. En el caso del ADN genómico humano, puede compararse con SRM 2372a o con un estándar secundario calibrado con SRM 2372a.
¿Qué longitud tiene la secuencia de la diana de ValidPrime?
La secuencia de la diana de ValidPrime humana tiene 143 bp y el ensayo está ampliamente caracterizado.
¿Cómo puede demostrar que no hay productos secundarios incompletos en la síntesis química del estándar?
No es necesario. Lo que se hace es medir la cantidad de estándar intacto (dentro de lo razonable) con el ensayo de ValidPrime.
¿Es necesario limpiar los reactivos?
Depende del estudio. Para la medición de variaciones en el número de copias, la contaminación de gADN humano en los reactivos es insignificante, pero para la cuantificación de la mitocondria en las células podría ser importante, y para el análisis de ADN antiguo, podría ser decisivo.
La detección de dianas basada en EvaGreen suele ser más desordenada que los ensayos basados en sondas. ¿Cómo pueden mejorarse los ensayos con EvaGreen?
EvaGreen se asocia de manera no específica a todos los ADNbc presentes, por lo que el fondo depende de la longitud del fragmento de la gotícula. Normalmente, podrá reducir el ruido de fondo gracias a la homogeneización de la longitud del fragmento a partir de una escisión de restricción, preferiblemente (para así no cortar la secuencia de la diana) o mediante sonicación. También puede disminuir el ruido de fondo reduciendo la cantidad total del ADN cargado.
En lo que respecta al rendimiento de los instrumentos de la dPCR, ¿es óptimo para todos o algunos son mejores que otros?
El rendimiento de los instrumentos de dPCR difiere ya que tienen distintas características, como el número de divisiones, canales, detección en tiempo real, múltiples lecturas, sistemas de apertura y cierre, etc. Por esto también varía el coste de cada instrumento. El mejor para cada caso dependerá de las necesidades específicas. Quizás le interese participar en el curso de dPCR de TATAA, que le permite probar las plataformas más importantes para ayudarle a tomar la decisión correcta.
Utilizo las ddPCR para la detección de microrganismos patógenos del entorno diagnóstico molecular. ¿Hasta qué punto se me permitiría usar las ddPCR para calibrar mis ensayos con qPCR?
La calibración es fiable si las condiciones del ensayo coinciden (es decir, si se aplican el mismo protocolo y los mismos reactivos). Sin embargo, la inhibición en muestras de campo es algo frecuente, por lo que deben realizarse pruebas para detectarla. Esto se hace mediante una punta.
En cuanto a la comparación de la sensibilidad entre qPCR y dPCR, el volumen de la muestra que se debe colocar en el instrumento es lo que determina el límite de la cuantificación, ¿no? ¿Qué cantidad de muestra es la normal para los instrumentos de dPCR y para los de qPCR?
En condiciones en las que el ruido de la muestra (distribución de Poisson) es dominante, el volumen total que se analiza es limitante para la cuantificación. Para las qPCR, hay grandes variaciones en el volumen que se analiza. El volumen de reacción de BioMark IFC (Fluidigm) es solo alrededor de 10 nl y no ofrece ningún tipo de precisión a menos que la muestra se amplifique previamente para aumentar la concentración. Al mismo tiempo, el aAmp (AlphaHelix) utiliza una superconvección para analizar 100 µl. En dPCR, el volumen total puede controlarse ejecutando más submatrices o varios chips. Por ejemplo, el tamaño de la gotícula para QX200 es de 0,85 nl, lo que da un volumen total analizado de 17 µl si se utilizan 20.000 gotículas.
¿Las dPCR son adecuadas para aplicaciones de control de calidad que utilizan SNP (es decir, son capaces de calcular con precisión la concentración de alelos poco frecuentes a una escala de 0,1 %)?
Sí, sin duda. De hecho, es una de las aplicaciones más populares. Los ensayos deben ser muy específicos para evitar falsos positivos en divisiones que contienen varias moléculas nativas.
¿Qué software es adecuado para diseñar sondas para dPCR?
El diseño de ensayos para dPCR no difiere del de las qPCR. Puede usar su procedimiento de ensayo habitual.
¿Cuál es el tamaño máximo de ADN para las ddPCR de EVA/SYBR?
Es preferible emplear amplicones más largos porque emiten una mayor fluorescencia. No hay un tamaño máximo, siempre y cuando el tiempo de elongación sea suficiente para copiar la plantilla. Tampoco hay problema en lo que respecta a las estructuras secundarias. Por ejemplo, un rango razonable sería entre 100 y 250 bp.
¿Podría explicar un poco más acerca del multiplexado con distintas concentraciones de cebador en una única reacción. ¿Es fácil de distinguir solo mediante el uso de instrumentos o es necesario utilizar herramientas adicionales para analizar los resultados?
En el caso de ensayos bien diseñados y validados, amplificaciones clonales y muestras no complejas, debería poder distinguirse mediante el software estándar del instrumento. Sin embargo, es un sistema complejo de optimizar y preferimos usar sondas para el multiplexado.
¿Se pueden usar ensayos ValidPrime o ensayos de referencia para los procesos bacterianos? ¿Es posible validar dianas bacterianas?
Los ensayos estándar ValidPrime se pueden usar para validar ensayos recientemente diseñados para cualquier elemento diana, porque la validación se lleva a cabo con un molde sintético. Sin embargo, para utilizar el ensayo ValidPrime como referencia endógena, debe estar dirigido a la cepa. En TATAA se ofrece un número limitado de ensayos ValidPrime validados para determinadas especies, pero hay muchos más en la literatura desarrollada por los distintos grupos académicos. Es posible que no estén tan ampliamente validados, pero son igual de válidos para su propósito.