Enzymes, NGS, Caucasian female in wheelchair pipetting with a Black male and Asian female in background. Laboratory setting
Enzymes pour la biologie moléculaire

Nettoyage de réaction et amélioration du rendement

Les nettoyeurs parfaits

Les réactifs et les réactants résiduels peuvent compromettre les processus en aval. Utilisez la bonne préparation enzymatique pour nettoyer vos échantillons avant de passer à l’étape suivante. Accélérez et optimisez l’amplification et la transcription grâce à des additifs bien connus. 

Enzymes pour le clivage et le nettoyage des réactifs résiduels

Le nettoyage enzymatique des échantillons d’ADN à l’exonucléase I, la DNase I, la RNase A et aux protéases permet d’éliminer les amorces, les nucléotides et les enzymes avant une analyse des SNP, un séquençage à haut débit, un séquençage d’ADN de Sanger ou d’autres analyses en aval. 

L’enzyme DAPase TAGZyme et le système TAGZyme sont utilisés pour l’extraction de l’étiquette His à partir de protéines contenant un point d’arrêt de la DAPase intrinsèque (exprimé avec le vecteur pQE-2 TAGZyme) ou à partir de protéines contenant un point d’arrêt de la glutamine défini.

Enzyme   Activité Application
X8010L
Exonucléase I		 Prochainement L’exonucléase I clive l’ADN simple brin dans le sens 3’→5’,
libérant ainsi les mono/dinucléotides 5’ et laissant les
molécules d’ADN double brin et la terminaison 5’
intactes ; la digestion est inhibée par la présence de phosphate terminal
3’
  • Éliminer les amorces simple brin des réactions par PCR avant
    une analyse des SNP ou un séquençage d’ADN de Sanger
  • Éliminer les amorces simple brin pour les réactions par PCR imbriquées
  • Éliminer l’ADN simple brin linéaire, laissant ainsi l’ADN double
    brin dans l’échantillon
79254
DNase sans RNase
(1 500 unités Kunitz)
L’endonucléase qui ne clive pas spécifiquement l’ADN pour libérer des di-, tri-
et oligonucléotides avec l’extrémité phosphorylée 5’ et l’extrémité hydroxylée
3’, agit sur l’ADNsb et l’ADNdb,
la chromatine et les hybrides ARN:ADN
  • Éliminer l’ADN contaminant des solutions d’ARN avant
    le nettoyage et la concentration de l’ARN
  • Éliminer l’ADN des échantillons de protéines
  • Couper l’ADN avant d’intégrer des bases marquées
    dans l’ADN
  • Analyse de l’interaction ADN-protéine (Dosage d’empreinte)
19101
RNase A
Endoribonucléase qui dégrade l’ARNsb sur les résidus C et U
  • Éliminer l’ARN contaminant des préparations d’ADN
    plasmidique et génomique
  • Éliminer l’ARN des préparations de protéine recombinante
  • Cartographier les mutations d’une base dans l’ADN ou l’ARN
    (Dosage de protection de la RNase)
19131
Protéinase K
La QIAGEN Protéinase K est une protéase de type subtilisine isolée
à partir du champignon saprophyte Tritirachium album
  • Digestion de la protéase dans l’ADN et procédures d’isolement d’ARN
  • La protéinase K présente une forte activité spécifique ; stable sur
    une large gamme de températures et de valeurs de pH ; non inhibée
    par l’EDTA ; adaptée aux temps de digestion courts
19155
Protéase
La QIAGEN Protéase est une sérine protéase isolée à partir
d’une souche recombinante de Bacillus ; une alternative économique
à la protéinase K		 Digestion de la protéase dans l’isolement de l’ADN et de l’ARN natif à partir
de diverses sources
34362
Enzyme DAPase
TAGzyme
DAPase TAGZyme (dipeptidyl peptidase I recombinante)
  • Éliminer les dipeptides dans l’ordre, des étiquettes His N-terminales
    jusqu’au « point d’arrêt » exprimé avec le vecteur pQE TAGZyme
  • Production de protéines sans étiquette His pour :
    • Détermination de la structure de la protéine
    • Protéines thérapeutiques

Améliorer le rendement

Vous pouvez améliorer le rendement et la qualité des matrices en utilisant des protéines de liaison à l’ADN dans les réactions d’amplification et de séquençage. La protéine de liaison à l’ADN, la protéine du gène 32 issue du bactériophage T4 (T4gp32), accroît l’efficacité de l’amplification par PCR avec un certain nombre de matrices diverses. En outre, l’utilisation de la protéine de liaison à l’ADN simple brin (SSB) E. coli dans les réactions de séquençage d’ADN accroît la résolution des cycles de séquençage.

Un meilleur taux de transcription in vitro est possible grâce à un traitement à la pyrophosphatase inorganique, un composant essentiel des réactions pour la préparation d’ARN. Cette enzyme clive le pyrophosphate en deux molécules de phosphate et empêche la précipitation du pyrophosphate avec le magnésium.

Réactif   Activité Application
Y9030L
Protéine de liaison à l’ADNsb E. coli
Prochainement Se lie avec une grande spécificité à l’ADN simple brin ;
thermostable
  • Utile pour retenir les amorces
  • Utile pour améliorer la spécificité de la PCR
  • Utile pour permettre le séquençage d’ADN matriciels
    problématiques
Y9130L
Protéine du gène 32 T4		 Prochainement
 Stabilise les régions de l’ADNsb

Augmente la processivité de certaines ADN polymérases
Y9380L
Pyrophosphatase E. coli		 Prochainement
Pyrophosphatase inorganique capable de catalyser l’hydrolyse du
pyrophosphate inorganique pour former de l’orthophosphate*
  • Augmente le rendement d’ARN dans une réaction de transcription
  • Améliorer la réplication de l’ADN
Y9370L
Pyrophosphatase
thermostable		 Prochainement
 La pyrophosphatase thermostable est une enzyme recombinante
issue de Sulfolobus acidocaldarius qui catalyse l’hydrolyse du
pyrophosphate inorganique pour produire de l’orthophosphate†

Utile pour améliorer la réplication de l’ADN en PCR

Clivage de brin UDG

Le clivage de brin par UDG est un outil important en biotechnologie moléculaire, il permet le clivage contrôlé et localisé d’ADN simple brin et double brin synthétisé de façon chimique ou enzymatique avec une ou plusieurs intégrations de désoxyuridine (dUTP). 

Éliminez les artefacts avant le NGS
Éliminez les artefacts avant le NGS
Le traitement par UDG élimine les artefacts de l’uracile (cytosine désaminée) des tissus tumoraux FFPE et réduit les artefacts dans l’ancien ADN avant le séquençage à haut débit (NGS). 
Éliminez la contamination par « transfert » de PCR
Éliminez la contamination par « transfert » de PCR
L’UDG thermolabile élimine les « transferts » de PCR lorsque les produits de PCR sont susceptibles de se dégrader en remplaçant la dTTP par la dUTP dans la réaction primaire.
Générez des brèches dans les résidus d’uracile
Générez des brèches dans les résidus d’uracile
Le mélange enzymatique 10x Uracil Cleavage System est capable de générer des brèches mononucléotidiques à l’emplacement spécifique de résidus de désoxyuridine.
Les traitements par UDG peuvent réduire les artefacts de la séquence, éliminer les transferts de PCR et générer des brèches spécifiques dans l’ADN.
 Enzyme   Activité Application

19160, G5010L
Uracile-ADN
glycosylase (UDG)

G5020L
UDG thermolabile

 Prochainement
 L’uracile-ADN glycosylase (UDG) intervient dans la réparation
par excision de base ; l’UDG crée des sites abasiques dans l’ADN contenant l’uracile ;
dégrade l’ADN contenant l’uracile

  • Le prétraitement de l’ADN à l’UDG réduit les artefacts dans l’ADN pendant
    la détection des mutations par séquençage à haut débit et autres
    méthodes, sans que cela compromette la capacité à détecter les véritables mutations

  • Élimine les artefacts de l’uracile (cytosine désaminée) des préparations
    FFPE

  • L’UDG thermolabile peut être utilisé pour éliminer la contamination par « transfert »
    de PCR lorsque la dTTP est remplacée par la dUTP dans le
    mélange réactionnel de PCR primaire

Y9180L
10X Uracil Cleavage
System		 Prochainement
 Ce système comprend deux composants d’enzyme : l’uracile
-ADN glycosylase et l’endonucléase VIII. Lorsque les enzymes
sont ajoutées dans l’ordre à une réaction dans laquelle un fragment d’ADN
synthétique contient un désoxyuracile, une brèche mononucléotidique
se forme à l’emplacement du résidu d’uracile
  • Génère de façon enzymatique des brèches nucléotidiques d’uracile in vitro
  • L’UDG est une enzyme spécifique à l’ADN qui ne retire pas l’uracile
    des substrats d’ARN. L’intégration ciblée de nucléotides
    de la désoxyuridine dans les oligonucléotides peut être utilisée avec le
    système enzymatique pour le clivage spécifique de sections d’ADN,
    ou ADN matriciel, à partir d’hybrides ADN:ARN.
Y9080L
Endonucléase VIII		 Prochainement
 L’endonucléase VIII fonctionne comme glycosylase N
(en détachant les lésions de base oxydatives) et comme lyase AP (en
clivant ensuite la chaîne principale de phosphodiester), laissant
les phosphates terminaux aux extrémités 5’ et 3’ ; elle participe à la réparation
de l’excision de base des dommages à l’ADN liés à l’oxydation 
  • Retire les pyrimidines endommagées de l’ADN double brin
  • Utilisé pour mesurer les dommages à l’ADN par électrophorèse
    sur gel unicellulaire (Dosage « comète »)
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FAQ sur la réduction des artefacts et le nettoyage de réaction

Comment le traitement par UDG et endonucléase génère-t-il des brèches dans l’ADN ?

L’uracile-ADN glycosylase reconnaît une base d’uracile puis élimine l’uracile de l’ADN en clivant la liaison N-glycosidique, cela forme un site abasique (site AP). In vivo, l’UDG demeure liée au site AP jusqu’à ce qu’elle soit remplacée par des endonucléases spécifiques ayant une affinité bien supérieure avec les sites abasiques. Ces enzymes, comme l’endonucléase VIII ou l’endonucléase III, présentent une activité de lyase AP qui catalyse le clivage de la chaîne principale de phosphodiester 3’ et/ou 5’ au niveau du site AP, cela libère le désoxyribose sans base et forme ainsi une brèche mononucléotidique.

Comment la protéine de liaison à l’ADN simple brin E. coli améliore-t-elle le rendement en ADN ?

La protéine de liaison à l’ADN simple brin (SSB) se lie de préférence à l’ADN simple brin, formant ainsi un tétramère de quatre sous-unités identiques de 18,9 kDa qui protège 8 à 16 nucléotides. Cette même protéine ne se lie pas bien à l’ADN double brin. Par nature, la SSB participe à la réplication de l’ADN ainsi qu’à la recombinaison et à la réparation. In vitro, la SSB a su stimuler certaines réactions par ADN polymérase en relâchant la structure secondaire de l’ADN et en améliorant la processivité de l’enzyme.
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