Clonage et recombinaison d’ADN

En raison de son activité exonucléase 5'→3', l’ADN polymérase I de E. coli n’est pas adaptée à de nombreuses applications. Le fragment de Klenow, la partie importante qui contient la polymérase 5'→3' et l’exonucléase d’édition 3'→5', ne présente pas une telle activité, ainsi il est intéressant pour les applications de recherche, notamment la synthèse de l’ADN double brin à partir de matrices simple brin, le remplissage des extrémités 3' en retrait de fragments d’ADN visant à rendre les extrémités des surplombs 5' franches, la digestion des surplombs 3' et la préparation de sondes d’ADN marquées. 

À l’instar de l’activité exonucléase 5'→3' de l’ADN polymérase I de E. coli, l’activité exonucléase 3'→5' du fragment de Klenow est parfois non souhaitable pour certaines applications. Ce problème est résolu en introduisant des mutations grâce auxquelles l’enzyme du fragment de Klenow (exonucléase 3'→5') conserve l’activité polymérase 5'→3' mais pas l’activité exonucléase. Le fragment de Klenow (exonucléase 3'→5') est utilisé dans certaines réactions avec marquage fluorescent sur puce à ADN, et dans l’extension homopolymérique dA et dT, une étape importante du processus de ligature des adaptateurs d’ADN aux fragments d’ADN, fréquemment utilisée pour préparer les banques d’ADN pour le séquençage à haut débit (NGS).

L’ADN polymérase du phage T4 fait partie de la famille des polymérases A qui comprend l’ADN polymérase I de E. coli, la Taq ADN polymérase et l’ADN polymérase mitochondriale. L’ADN polymérase T4 peut être utilisée pour remplir les surplombs 5’ avec des dNTP marqués ou non marqués ou pour générer des extrémités franches à partir de molécules d’ADN avec des surplombs 3'. L’ADN polymérase T4 dépend de la matrice, nécessite une amorce et ne présente aucune fonction exonucléase 5’→3’. L’ADN polymérase T4 peut être utilisée dans le clonage de produits de PCR indépendants de la ligature. 

Le clonage indépendant de la ligature (Ligation Independent Cloning, LIC) est une technique alternative au clonage par enzymes de restriction/ligases. Les inserts sont amplifiés par PCR et les vecteurs sont linéarisés par digestion d’enzymes de restriction ou par PCR. Le LIC utilise l’activité exonucléase 3’→5’ de l’ADN polymérase T4 pour créer des surplombs avec une complémentarité entre le vecteur et l’insert. Dans le SLIC (Clonage indépendant de la séquence et de la ligature) en une étape, le vecteur linéarisé et les inserts amplifiés par PCR sont mélangés dans un même tube puis traités à l’ADN polymérase T4. La réaction est interrompue par l’incubation du mélange sur la glace, puis les brèches et les surplombs sont réparés une fois le mélange introduit dans les cellules de E. coli compétentes.

L’ADN ligase T4 est la ligase la plus communément utilisée et la plus polyvalente en recherche de laboratoire, car cette enzyme est capable de ligaturer des extrémités cohésives ou franches d’ADN et des oligonucléotides. L’ADN ligase T4 peut réparer des cassures simple brin dans un ADN double brin mais ne ligature pas d’acides nucléiques simple brin. L’ADN ligase T4 lie les molécules d’ARN lorsqu’elles se trouvent dans un hybride ARN:ADN. La ligature des extrémités d’ADN cohésives avec l’ADN ligase T4 peut s’effectuer entre 12 et 16 °C pour assurer un bon équilibre entre l’activité enzymatique et la stabilité des surplombs d’ADN renaturés. L’ADN ligase T4 peut être thermo-inactivée par incubation à 65 °C pendant 10 minutes.