La PCR numérique (dPCR) suscite un intérêt croissant, car les progrès technologiques la rendent de plus en plus accessible et peu coûteuse. Par conséquent, la dPCR peut avoir un impact notable sur la recherche en sciences de la vie et sur les applications cliniques. En octobre 2019, nous avons organisé un webinaire invité dans lequel des directives pour l’exploitation de cette technologie prometteuse ont été présentées.
Nous avons enregistré de nombreuses questions intéressantes posées par les participants à notre webinaire. Lisez notre compilation des 20 questions principales ainsi que des réponses perspicaces de l’invité.
Pour écouter l’enregistrement de ce webinaire ainsi que la discussion qui a suivi, cliquez sur le lien ci-dessous.
“Conseils et astuces pour la PCR numérique plus précise”, présentés par le Dr Mikael Kubista, TATAA Biocenter AB et Service de biotechnologie, CAS
Session de webinaire enregistrée – regarder ici
Dans ce webinaire expert, M. Kubista a partagé son expérience de presque 12 ans du développement d’applications et de la prestation de services à l’aide de la PCR numérique au TATAA Biocenter. Avec son équipe, ils ont surmonté tous les problèmes communs aux méthodes analytiques de dPCR et développé des procédures opérationnelles normalisées afin de minimiser le risque d’erreur et de maximiser la robustesse et la répétabilité. Ils ont développé différents contrôles pour tester les performances et valider les méthodes. Il a également partagé des conseils et des astuces pour la conception et la validation de dosages de dPCR, en mettant l’accent sur les stratégies de détermination du nombre de copies et de détection des mutations rares.
Questions-réponses postwebinaire :
Le calcul de 1,6 copie/partition et la saturation de 80 % étaient basés sur 10k partitions. Comment cela change-t-il si le nombre de partitions augmente ?
Cela ne change pas. 1,6 copie par partition, soit une saturation de 80 %, représente une condition optimale pour la précision, indépendamment du nombre de partitions. L’imprécision (l’erreur) diminue généralement, avec toutefois un nombre de partitions en augmentation.
Si vous augmentez le nombre de partitions, pouvez-vous détecter une seule molécule au lieu de la LOD = 3 ?
En supposant que le dosage soit bon, la PCR amplifie une seule molécule, et donc la détecte. La LOD ne concerne pas la détection d’une molécule qui serait présente. Il s’agit de la probabilité qu’une molécule soit chargée sur la puce, car nous analysons seulement une petite fraction de l’échantillon total (p. ex. le sang du patient). L’échantillon doit contenir au moins 3 molécules cibles par volume total analysé pour que l’analyse soit positive avec une probabilité de 95 %. Donc, si un échantillon contient 3 cibles par volume analysé et que l’expérience est répétée 100 fois, on s’attend à ce que 95 expériences soient positives, mais que 5 soient négatives. La LOD est indépendante de la technique de mesure. C’est une conséquence de l’ambiguïté de l’échantillonnage.
Lors de la validation de nouveaux dosages par rapport à ValidPrime, si vous utilisez des fragments synthétiques contenant les deux séquences cibles, à quelle fréquence les concentrations mesurées dans les deux dosages sont-elles différentes ?
Les concentrations sont identiques, car elles font partie de la même molécule, mais je suppose que vous voulez demander si les quantités mesurées sont différentes. Il est important d’effectuer les dosages en singleplex, en optimisant chaque dosage séparément puisqu’ils peuvent nécessiter des conditions d’exécution différentes. Une fois optimisés, la plupart des dosages que nous avons conçus en interne satisfont à la validation (c.-à-d. même quantité que ValidPrime).
L’exactitude de la quantification absolue s’améliore-t-elle avec les dPCR en gouttelettes ?
Lorsque l’on estime les concentrations des échantillons testés à partir d’une courbe d’étalonnage, l’incertitude dépend de plusieurs facteurs, et l’incertitude de la mesure en fait partie. Puisque la reproductibilité est plus élevée en dPCR qu’en qPCR, en raison de la réponse linéaire, je m’attendrais à ce que ce soit le cas en théorie. En pratique, la plupart des méthodes comportent des étapes préanalytiques en amont qui ont plus de facteurs de confusion que l’étape analytique, auquel cas, il n’y a aucune différence.
Compte tenu des options de multiplexage plus élevé en dPCR, peut-on utiliser des dilutions de moitié des sondes pour toutes les plateformes de dPCR ?
Oui, mais rappelez-vous que vous avez besoin d’amplification clonale, ce qui est plus facile à réaliser sur les plateformes comportant un grand nombre de partitions.
L’efficacité des amorces peut-elle influencer la séparation des séquences cibles lors du duplexage avec un dosage à colorant unique ? J’en ai fait l’expérience récemment en utilisant le même colorant dans un dosage duplex, et on a pu distinguer les cibles même sans modifier les concentrations des amorces. Cela peut-il être une question d’efficacité des amorces ?
Je suppose que vous faites référence à l’efficacité du dosage. Vous avez raison : on peut distinguer les cibles à l’aide de cette stratégie. Si les amorces ont des Tm ou des amplicons différents, les différentes longueurs nécessitent des temps d’élongation différents. Les conditions du thermocyclage peuvent être définies pour amplifier les cibles avec des efficacités très différentes. On peut alors facilement distinguer les cibles à partir des valeurs de Cq. Cela nécessite toutefois une détection en temps réel. On peut aussi les distinguer par dPCR en point final conventionnelle, mais c’est beaucoup moins robuste.
Comment quantifier la concentration d’ADN à l’aide de la dPCR ?
Pour la souris, l’homme et le rat, il existe les dosages ValidPrime. Pour les autres organismes, vous devez concevoir et valider vos dosages. Il faut pour cela concevoir plusieurs dosages ciblant des loci à copie unique dans l’ADN qui vous intéresse et effectuer une dPCR. Si plusieurs dosages donnent le même nombre, il est raisonnable de supposer que ces dosages ciblent effectivement des loci à copie unique et sont quantitatifs. Vous trouverez plus d’informations ici : http://www.tataa.com/services/.
Pouvez-vous recommander des procédures pour la validation de la dPCR en termes d’exactitude ?
L’exactitude nécessite une comparaison avec un étalon ou une méthode de référence. Pour l’ADN génomique humain, comparez avec le SRM 2372a ou un étalon secondaire calibré par rapport au SRM 2372a.
Quelle est la longueur de la séquence cible ValidPrime ?
La séquence cible ValidPrime humaine est de 143 pb, et le dosage a été caractérisé en détail.
Comment faites-vous pour prouver qu’il n’y a pas de produits secondaires incomplets provenant de la synthèse chimique de l’étalon ?
C’est inutile. Vous mesurez la quantité d’étalon (raisonnablement) intact à l’aide du dosage ValidPrime.
Doit-on décontaminer les réactifs ?
Cela dépend de l’étude. Pour les mesures de la variation du nombre de copies (CNV), la contamination par l’ADNg humain dans les réactifs devrait être négligeable. Pour la quantification des mitochondries dans les cellules, elle peut être importante, et pour l’analyse de l’ADN ancien, elle peut jouer un rôle majeur.
La détection à l’aide d’EvaGreen est généralement qualifiée de « plus brouillée » que les dosages avec une sonde. Comment peut-on améliorer les dosages avec EvaGreen ?
EvaGreen se lie de manière non spécifique à tout l’ADNdb présent, et donc le fond dépend de la longueur du fragment dans la gouttelette. Vous pouvez généralement réduire la « pluie » de fond en homogénéisant la longueur des fragments à l’aide d’un clivage enzymatique de restriction (afin d’éviter de couper la séquence cible) ou d’une sonication. Vous pouvez aussi essayer de réduire la « pluie » en diminuant la quantité totale d’ADN chargé.
Les performances de tous les instruments de dPCR sont-elles comparables, ou certains sont-ils meilleurs que d’autres ?
Les performances des instruments de dPCR diffèrent en raison de leurs caractéristiques spécifiques, comme le nombre de partitions, les canaux, la détection en temps réel, les lectures multiples, les systèmes ouverts ou fermés, etc. Autant de paramètre qui se reflètent dans le coût de l’instrument. Le meilleur instrument pour vous dépend de vos besoins. Vous devriez envisager de suivre le cours de dPCR offert par TATAA, dans lequel vous aurez l’occasion de tester les principales plateformes pour orienter votre décision.
J’utilise la ddPCR pour la détection des pathogènes environnementaux dans le cadre de diagnostics moléculaires. Dans quelle mesure puis-je utiliser la ddPCR pour calibrer mes dosages de qPCR ?
L’étalonnage est fiable si les conditions de dosage sont identiques (protocole et réactifs identiques). Mais l’inhibition des échantillons sur le terrain est fréquente et doit être vérifiée. On utilise pour cela un pic.
Concernant la comparaison entre la sensibilité de la qPCR et de la dPCR. Le volume d’échantillon à introduire dans l’instrument est ce qui détermine la limite de quantification, n’est-ce pas ? Quelle est la quantité habituelle d’échantillon introduite dans les instruments de dPCR et de qPCR ?
Dans des conditions où le bruit d’échantillonnage (distribution de Poisson) est dominant, le volume total analysé devient un facteur limitant pour la quantification. Pour la qPCR, il y a d’immenses variations dans le volume analysé. Le volume réactionnel du BioMark IFC (Fluidigm) n’est que de 10 nl, et il n’y a aucune exactitude à moins que l’échantillon ne soit préamplifié pour augmenter la concentration. Parallèlement, l’aAmp (AlphaHelix) fait appel à la superconvection pour analyser 100 µl. Dans la dPCR, vous pouvez généralement contrôler le volume total en exécutant des sous-arrays ou plusieurs puces. Par exemple, la taille des gouttelettes du QX200 est de 0,85 nl, ce qui donne un volume total analysé de 17 µl, en supposant qu’il y ait 20 000 gouttelettes.
La dPCR serait-elle adaptée aux applications de contrôle qualité à l’aide de SNP (p. ex. pour être en mesure d’estimer précisément la concentration d’un allèle rare de l’ordre de 0,1 %) ?
Oui, tout à fait. C’est l’une des applications les plus courantes. Les dosages doivent néanmoins être spécifiques pour éviter les faux positifs dans les partitions qui contiennent plusieurs molécules de type sauvage.
Quel logiciel utiliser pour concevoir des sondes de dPCR ?
La conception du dosage pour la dPCR n’est pas différente de la qPCR. Utilisez votre pipeline de conception de dosage habituel.
Quelle est la taille maximale de l’ADN pour la ddPCR avec Eva/SYBR ?
Les amplicons de plus grande taille sont préférables, car ils donnent lieu à plus de fluorescence. Il n’y a pas de limite supérieure si le temps d’élongation est suffisant pour copier la matrice et qu’il n’y a aucun problème avec les structures secondaires. Il est raisonnable de viser une gamme de 100–250 pb.
Pourriez-vous donner un peu plus d’explications sur le multiplexage avec différentes concentrations d’amorce dans une seule réaction ? Est-ce facile à distinguer à l’aide des seuls instruments, ou a-t-on besoin d’outils supplémentaires pour analyser ces résultats ?
Concernant les dosages bien conçus et validés, l’amplification clonale et les échantillons non problématiques, il doit être possible de faire la distinction avec les logiciels d’instrument courants. Mais, ce systèe est difficile à optimiser, et nous préférons utiliser des sondes pour le multiplexage.
Peut-on utiliser des dosages ValidPrime ou des dosages de référence pour les processus bactériens ? Peut-on valider des cibles bactériennes ?
Vous pouvez utiliser le dosage ValidPrime ordinaire pour valider des dosages nouvellement conçus pour n’importe quelle cible, puisque la validation est effectuée sur une matrice synthétique. Toutefois, pour être utilisé comme référence endogène, le dosage ValidPrime doit cibler la souche. TATAA n’offre qu’un nombre limité de dosages ValidPrime validés spécifiques à une espèce, mais vous en trouverez peut-être d’autres dans la littérature publiée par des groupes de recherche universitaires. Bien qu’ils puissent ne pas être validés d’une façon aussi approfondie, cela peut suffire à répondre à votre objectif.