Enzymes pour détection | Dommages à l’ADN, cartographie des exons, liaison de protéine

Détecter et découvrir avec les empreintes et les fragments

Grâce aux enzymes, vous pouvez découvrir les sites de liaison des protéines à l’ADN, déterminer le nombre de transcriptions, révéler les substitutions d’une base, cartographier les exons, visualiser l’apoptose et mesurer les dommages à l’ADN dans les cellules.

L’empreinte enzymatique permet de caractériser les interactions ADN-protéine

Empreinte à la DNase I

L’empreinte enzymatique à la DNase I permet d’identifier et caractériser les interactions ADN-protéine
La digestion enzymatique partielle par la DNase I d’un fragment d’ADN marqué à son extrémité de façon unique génère un marqueur de poids moléculaire de fragment
Les mobilités sur un gel d’acrylamide dénaturant représentent la distance entre le marquage d’extrémité et les points de clivage enzymatique
La protéine liée empêche la liaison de la DNase I et laisse une « empreinte » visible sur le clivage

Empreinte à l’exo III avec FRET

La cible de la protéine de liaison à l’ADN se lie à deux sites de liaison de protéine de la sonde FRET
L’encombrement physique protège la paire FRET de la digestion enzymatique par l’exo III et donne un signal FRET élevé
En l’absence de protéine cible, la sonde FRET nue est dégradée par l’exo III
La proximité de la paire FRET est détruite, ce qui donne un signal FRET faible

Les ruptures de l’ADN sont des signes d’apoptose et de génotoxicité

Détection de l’apoptose par marquage in situ des ruptures de l’ADN

La technique TUNEL est basée sur l’activité enzymatique de la TdT pour catalyser les longues séquences d’ADN simple brin à n’importe quelle extrémité 3’-OH libre
La technique ISEL utilise les enzymes du fragment de Klenow ou de l’ADN polymérase T7 pour marquer l’extrémité 5' proéminente par le biais d’une réaction temporaire

La technique ISEL basée sur l’ADN polymérase T7 est plus rapide et plus simple que d’autres approches in situ avec enzymes, elle permet en outre d’identifier les cellules apoptotiques à un stade plus précoce que la technique TUNEL.

Dosage « comète » (électrophorèse sur gel unicellulaire)

Permet de mesurer les dommages à l’ADN dans les cellules eucaryotes et la génotoxicité environnementale
Permet de détecter les ruptures dans le brin d’ADN et les sites alcali-labiles

La digestion enzymatique à l’endonucléase VIII détecte spécifiquement les purines altérées et ces emplacements sont convertis en ruptures par l’enzyme.

La digestion par la RNase A localise les substitutions d’une base et cartographie les transcriptions

Localisation des substitutions d’une base

Détectez les substitutions par clivage enzymatique RNase A des mésappariements d’une base dans un hétéroduplex ARN:ADN
Une sonde d’ADN marquée complémentaire à l’ADN de type sauvage est renaturée afin de tester l’ADN contenant une substitution d’une base suspectée
Le mésappariement d’une base ainsi obtenu est clivé par la RNase A
L’emplacement du mésappariement est déterminé en analysant les tailles des produits du clivage enzymatique par électrophorèse sur gel

Mesure et caractérisation des transcriptions

Déterminez le nombre de transcriptions et cartographiez les terminaisons d’ARNm ainsi que les limites intron/exon grâce au dosage de protection de la ribonucléase

Hybridez l’ARN dans une solution contenant une sonde antisens marquée
Digérez l’ARN total avec la RNase A afin d’extraire le matériel non hybridé
Précipitez le matériel obtenu puis appliquez-le sur un gel d’acrylamide dénaturant
Transférez sur une membrane pour la détection des sondes non isotopiques et d’autres analyses

La capacité des enzymes à synthétiser ou digérer les acides nucléiques, les cliver en des sites spécifiques ou détacher des bases individuelles d’une chaîne permet d’utiliser ces attributs pour répondre à des questions relatives à la détection, au dosage et à l’analyse.

Enzyme		Activité	Dosage
79254 DNase sans RNase (1 500 unités Kunitz)		L’endonucléase qui ne clive pas spécifiquement l’ADN pour libérer des di-, tri- et oligonucléotides avec l’extrémité phosphorylée 5’ et l’extrémité hydroxylée 3’, agit sur l’ADNsb et l’ADNdb, la chromatine et les hybrides ARN:ADN	Analyse de l’interaction ADN-protéine (Dosage d’empreinte pour les protéines de liaison à l’ADN)
X8020L Exonucléase III	Prochainement	Exonucléase qui détache les bases de l’ADN double brin dans le sens 3’→5’	Analyse de l’interaction ADN-protéine (Dosage d’empreinte pour les protéines de liaison à l’ADN)
19101 RNase A		Endoribonucléase qui dégrade l’ARNsb sur les résidus C et U	Déterminer le nombre relatif ou absolu de transcriptions Cartographier les terminaisons d’ARNm ainsi que les limites intron/exon (Dosage de protection de la RNase) Cartographier les mutations d’une base dans l’ADN ou l’ARN par le clivage sur le mésappariement d’une base dans un hybride ARN:ADN
P7260L ADN polymérase T7	Prochainement	ADN polymérase avec un taux élevé de synthèse et de réplication, une protéine à deux sous-unités avec un domaine de polymérase et un facteur de processivité (thiorédoxine E. coli)	Marquage in situ des dommages à l’ADN (Dosage d’apoptose)
Y9080L Endonucléase VIII	Prochainement	L’endonucléase VIII fonctionne comme glycosylase N (en détachant les lésions de base oxydatives) et comme lyase AP (en clivant ensuite la chaîne principale de phosphodiester), laissant les phosphates terminaux aux extrémités 5’ et 3’ ; elle participe à la réparation de l’excision de base des dommages à l’ADN liés à l’oxydation	Mesure des dommages à l’ADN par électrophorèse sur gel unicellulaire (Dosage « comète »)

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FAQ sur les enzymes pour dosages et détection

L’ADN polymérase T7 en soi présente une faible processivité. Il se sépare d’une matrice d’amorce après l’ajout de < 15 nt. Lors d’une infection à E. coli, le phage T7 annexe une protéine hôte, la thiorédoxine, et fait office pour celle-ci de facteur de processivité. L’ADN polymérase T7 et la thiorédoxine se lient pour former un même complexe et la liaison de la thiorédoxine à l’ADN polymérase T7 intensifie 80 fois l’affinité spécifique de la polymérase à une matrice d’amorce. La conséquence de cette affinité accrue pour une matrice d’amorce est la capacité de l’ADN polymérase T7 à rallonger une amorce sur l’ADN simple brin de plusieurs milliers de nucléotides sans dissociation, ce qui permet une synthèse continue des longs étirements d’ADN. L’ADN polymérase T7 peut être utilisée pour la purification de l’ADN circulaire en retirant l’ADN génomique résiduel, afin de synthétiser les brins d’ADN complémentaire.

Autre application, la détection in situ de l’ADN fragmenté apoptotique par marquage des césures présentes dans l’ADN double brin. La processivité élevée, l’activité intense des exonucléases 3’→5’ et la capacité à tolérer divers nucléosides triphosphates étiquetés sont les propriétés les plus importantes pour l’utilisation de l’ADN polymérase T7 pour le marquage in situ des dommages à l’ADN.

Le dosage « comète » in vivo est un test de génotoxicité conforme aux directives de l’OCDE. Dans sa forme standard, il détecte les dommages à l’ADN sous forme de cassures dans le brin et les sites alcali-labiles. En ajoutant une étape supplémentaire au dosage, au cours de laquelle l’ADN est incubé avec une enzyme propre à une lésion, on peut obtenir des informations importantes sur la nature spécifique des dommages à l’ADN.

La plupart des applications du dosage de réparation concerne la biosurveillance humaine. Chaque jour, les populations humaines sont exposées à des composés mutagènes et carcinogènes, au niveau professionnel comme environnemental. Pour ce qui est de l’exposition au travail, les individus sont exposés à des composés génotoxiques/mutagènes, par exemple : pesticides, produits de coloration capillaire, formaldéhyde, substances antinéoplasiques, solvants organiques, etc.

La technique de dosage « comète » est basée sur l’électrophorèse de nucléoïdes uniques (ADN rattaché à la matrice cellulaire après la lyse cellulaire et le retrait des histones), cela donne une image de type comète, l’intensité de la queue variant selon la fréquence des cassures qui défont le superenroulement et permettent la migration des boucles d’ADN contenant les cassures. La digestion des nucléoïdes avec des endonucléases propres à une lésion permet de détecter diverses lésions de l’ADN.

L’endonucléase VIIII (endo VIII) issue d’E. coli élimine une grande partie des bases pyrimidiques lésées par l’oxydation, notamment les produits de la radiolyse de la thymine incluant glycol de thymine et urée. Cette enzyme est utilisée dans le dosage « comète » pour indiquer cette catégorie de dommage à l’ADN. L’endo VIII agit sur la réparation par excision de base (BER) et catalyse l’hydrolyse de la liaison N-glycosidique (N-glycosylation). La base libre modifiée et le site apurinique/apyrimidique (AP) sont ainsi formés. Ensuite, le clivage du site AP passe par l’élimination β, δ (lyase AP) et produit une cassure de l’ADN simple brin. Le dosage détecte la cassure et la lésion est identifiée.

L’analyse d’empreinte à la DNase I de l’endo VIII montre la protéine qui se lie à l’ADN sous forme de petite empreinte avec les sites de contact principalement sur le brin lésé.

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