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PCR

Conception de lignées cellulaires

Malgré les progrès réalisés en matière de CRISPR et d’autres technologies d’ingénierie cellulaire, le parcours entre une cellule de départ et une cellule modifiée reste long et délicat. Et s’il existait un moyen d’améliorer et d’accélérer votre flux de travail de développement de lignées cellulaires tout en découvrant tous les changements génomiques involontaires ?

Vue d’ensemble

Les vulnérabilités de la conception de lignées cellulaires
  • Compte tenu du faible taux de réussite des techniques d’édition génétique, le criblage des clones édités avec succès et la caractérisation des modifications peuvent prendre plusieurs mois.
  • L’édition de gènes, la transduction virale ou même les transfections de routine peuvent provoquer des effets hors cible tels que des réarrangements chromosomiques et des variants structuraux, souvent non détectés par les méthodes classiques comme le caryotypage et la technologie FISH.
Une semaine pour :
Une semaine pour :
  • Transfection
  • Transduction
  • Édition génique CRISPR
Plusieurs mois pour :
Plusieurs mois pour :
  • Sélection des clones
  • Séquençage Sanger
  • Validation qPCR
  • Analyse d’expression génique
Kits CRISPR et QuantiNova
Plusieurs semaines pour :
Plusieurs semaines pour :
  • Évaluation de l’intégrité génomique
  • Analyse hors cible
  • Séquençage d’ARN
Kit Epitect HI-C
Ne sacrifiez pas la vitesse en faveur de la qualité : combinez les deux dans votre processus de sélection de clones et de caractérisation des lignées cellulaires
Cell line developement benefits illustration

Sélection et enrichissement des clones

Le criblage des CRISPR vous occupe pendant des semaines ?

Supprimez les tâches inutiles de votre caractérisation des modifications géniques CRISPR. Regardez la vidéo pour découvrir comment.


Comment caractériser vos modifications génétiques CRISPR plus rapidement et plus facilement
Prenez un chemin 3 fois plus rapide pour arriver à votre clone d’intérêt

Caractérisez les modifications géniques CRISPR en 3 jours en utilisant seulement 10 cellules/µL. 

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Analyse de l’expression génique – validez les modifications génétiques au niveau de la transcription à l’aide de QuantiNova PCR
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Effectuez la qPCR directement à partir des cellules

Minimisez le temps et les efforts nécessaires pour identifier votre clone d’intérêt.

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Prêt à accélérer votre flux de travail de sélection de clones ?
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Caractérisation de lignées cellulaires

Révélez le statut génomique réel en 5 jours
Regardez cette vidéo pour découvrir une approche simple mais efficace pour rechercher des changements génomiques involontaires dans vos cellules génétiquement modifiées.
Identifiez les altérations chromosomiques dès le début du développement de la lignée cellulaire
Pourquoi choisir EpiTect Hi-C plutôt que le caryotypage ou FISH ? 

Comparé aux méthodes classiques,  EpiTect Hi-C vous donne une vue 10X plus nette du génome, révélant les angles morts génomiques tels que les réarrangements chromosomiques et les variants structuraux.  Pour en savoir plus, consultez ce dépliant.  

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Devancez les changements involontaires qui se cachent dans vos cellules
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FAQ

Criblage CRISPR
Y a-t-il des choses à prendre en compte lors du traitement de cellules de culture sur des boîtes de culture enrobées ? Des étapes de purification supplémentaires sont-elles nécessaires pour éliminer ou réduire les réactifs d’enrobage tels que la poly-L-lysine ?
La préparation des échantillons QIAprep&amp CRISPR et l’amplification des cibles ne sont pas affectées par les réactifs d’enrobage. Vous trouverez des informations supplémentaires et la liste des réactifs d’enrobage testés dans le Manuel des kits QIAprep&amp CRISPR et CRISPR-Q Custom à l’annexe C.
Y a-t-il des choses à prendre en compte lors de la manipulation de cellules transduites traitées avec du polybrène ?
Le réactif chimique PCR AllTaq inclus dans le kit QIAprep&amp CRISPR est très robuste contre les inhibiteurs. La préparation des échantillons n’est pas affectée et la réaction PCR en tolère jusqu’à 1 µg/ml.
Les nouveaux dosages PCR CRISPR peuvent-ils être utilisés pour la PCR numérique (dPCR) sur le système QIAcuity ? Avez-vous des données ou un protocole ?
Le dosage PCR CRISPR-Q Custom n’est pas destiné à une utilisation en dPCR. Il s’agit d’un cycle PCR classique exécuté dans un thermocycleur standard, et le produit PCR est analysé sur le QIAxcel ou sur un gel. Le dosage PCR CRISPR-Q Custom contient 2 amorces encadrant le site de coupe. Le but est d’effectuer une vérification PCR rapide des clones ainsi que la préparation de la matrice pour le séquençage de Sanger suivant. Pour le séquençage de Sanger, les amorces CRISPR-Q Sanger correspondantes sont utilisées. La dPCR pour vérifier l’événement d’édition constitue une alternative au séquençage de Sanger et serait spécifique à l’événement.
EpiTect Hi-C
Y a-t-il des points d’interruption dans le flux de travail EpiTect Hi-C ?
Oui. Après les étapes de digestion Hi-C, de marquage final Hi-C, de ligature Hi-C ou de déréticulation de la chromatine dans le flux de travail Hi-C, partie 1, les utilisateurs peuvent stocker les échantillons entre −15 et −25 °C et reprendre la procédure ultérieurement.
Quel effet y a-t-il à utiliser des quantités de matériau entrant par échantillon en dehors de la plage recommandée ?
L’utilisation de quantités en entrée en dehors de la plage de 5 x 103 et 2,5 x 106 cellules humaines ou de souris (ou l’équivalent de 30 ng–15µg d’ADN) par échantillon risque d’affecter la qualité de la bibliothèque de séquençage haut débit (NGS) résultante, de telle sorte qu’il est probable qu’elle présente des niveaux plus élevés de biais de lecture de séquences tournées vers l’intérieur (FR), d’extrémités non ligaturées et de paires de lecture contenant des fragments de restriction contigus et religaturés.
Puis-je utiliser des cellules qui ont été préalablement réticulées et congelées (par exemple, pour une expérience ChIP ou ChIP-seq) comme matériau d’entrée pour le protocole EpiTect Hi-C ?
Oui. Cependant, les cellules doivent avoir été réticulées avec 1 % de formaldéhyde et ne pas avoir été congelées pendant plus de 6 mois.
Avec quelle plateforme puis-je effectuer mon séquençage ?
Les bibliothèques de séquençage EpiTect Hi-C sont compatibles avec toutes les plateformes de séquençage Illumina.
Puis-je utiliser mon propre pipeline pour analyser les résultats de mes expériences EpiTect Hi-C ?
Oui. Pour votre analyse, vous aurez besoin des informations supplémentaires suivantes. L’endonucléase utilisée dans le kit EpiTect Hi-C coupe au niveau des sites GATC. Les motifs de jonction Hi-C générés après la ligature Hi-C consistent en une séquence GATCGATC.
Avec quelle longueur de lecture les bibliothèques de séquençage haut débit EpiTect Hi-C doivent-elles être séquencées ?
Des longueurs de lecture de 36–150 pb peuvent être utilisées pour séquencer les bibliothèques EpiTect Hi-C sur les séquenceurs Illumina. Cependant, comme la capacité de cartographie augmente avec la longueur de lecture, nous suggérons d’utiliser des lectures de séquençage de 2 x 150 pb pour de meilleurs résultats.
QIAGEN assure-t-il l’analyse des données pour accompagner le kit EpiTect Hi-C ?
Oui. Visitez le centre d’analyse de données GeneGlobe en ligne de QIAGEN, à la section Analyse Hi-C (qiagen.com) pour analyser vos données avec le portail d’analyse de données EpiTect Hi-C.
Kit QuantiNova RT-PCR
Ai-je besoin d’un équipement spécifique pour analyser des cellules cultivées après une lyse directe au moyen des kits QuantiNova RT-qPCR ?
L’équipement de laboratoire standard et les thermocycleurs de real-time PCR sont adaptés à cette procédure. Pour sélectionner les dosages appropriés, rendez-vous sur Dosages QuantiNova LNA via GeneGlobe pour la détection de l’ARNm avec SYBR Green ou des sondes.
Combien de cellules sont nécessaires pour vérifier les niveaux d’expression génique de mon ou mes gène(s) modifié(s) en PCR directe ?
Les kits RT-qPCR en une étape QuantiNova peuvent détecter l’ARNm même à partir de cellules individuelles. Cependant, il faut tenir compte de l’abondance attendue du gène d’intérêt modifié pour sélectionner une quantité appropriée de cellules. Nous recommandons jusqu’à 2000 cellules par cuve de réaction PCR.
Quelles lignées cellulaires sont adaptées à la lyse directe et à la RT-qPCR ?
Diverses lignées cellulaires ont été utilisées avec succès dans le protocole de PCR direct décrit, et toutes les lignées cellulaires couramment utilisées vont a priori convenir à cette procédure.
Est-il nécessaire de laver les cellules avant la lyse directe et la RT-qPCR ?
Oui, du matériel extracellulaire ainsi que des débris et du matériel intracellulaire de cellules mortes, y compris des ARN, des RNases et des protéases, vont être libérés dans la culture cellulaire et peuvent interférer avec la RT-PCR. Nous recommandons fortement de les éliminer en lavant les cellules avec un milieu de culture cellulaire.
Dois-je préparer la réaction RT-PCR sur de la glace ?
Non, les kits QuantiNova qRT-PCR Kits utilisent une qRT-PCR à deux phases en une étape qui maintient la transcriptase inverse et la Taq polymérase inactives à température ambiante, permettant une préparation pratique à température ambiante sans compromettre les performances.