Conseils pour l’isolement de l’ARN

Conseil n° 1 : Prenez soigneusement en compte la quantité de l’échantillon de départ.

Pour la plupart des sols, la quantité maximale par échantillon est de 2 g. Mais pour les sédiments, un plus grand contenu aqueux signifie qu’il y a moins de particules de sol dans un échantillon de 2 g. Il peut en résulter une réduction des rendements en ARN alors que ces échantillons ont déjà une faible charge microbienne. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser jusqu’à 5 g de poids humide d’échantillon pour les sédiments.

Remarque : Si vous voyez une quantité notable d’eau au-dessus du sol après le prélèvement, vous pouvez centrifuger brièvement l’échantillon après l’avoir ajouté au tube de billes afin d’éliminer l’excès d’eau.

Conseil n° 2 : Utilisez un PCI adapté au sol

Il est important d’utiliser le rapport approprié de phénol : chloroforme : Le type d'alcool isoamylique (PCI) est important – voir les recommandations dans le manuel du kit. Le phénol doit être dans un rapport de PCI de 25:24:1, avec un pH compris entre 6,7 et 8 et un stockage sous une couche de tampon TE à pH 8.0. Contrairement aux échantillons de tissus et de cellules provenant d’animaux, pour lesquels un phénol à faible pH est approprié pour la préparation de l’ARN, les échantillons de sol requièrent un phénol à pH neutre pour l’obtention de meilleurs résultats.

Conseil n° 3 : Optimisez la précipitation à l’isopropanol.

Après l’extraction au PCI et l’addition à la solution SR3, la prochaine étape est la précipitation à l’isopropanol pour isoler les acides nucléiques totaux. Si vous avez commencé avec des sédiments, il est possible que vous ayez plus de 5 ml d’échantillon après avoir ajouté la SR3. Vous devrez augmenter la quantité de SR4 (isopropanol) pour égaliser le volume d’échantillon à l’étape 11 du protocole afin d’obtenir une précipitation complète.

Conseil n° 4 : Adaptez la température de la précipitation à l’isopropanol pour les échantillons à forte teneur en sel.

Le protocole standard du kit est de congeler les échantillons à -20 °C. Mais pour les échantillons à forte teneur en sel, il est préférable de réaliser la précipitation à température ambiante, parce que les températures inférieures à zéro entraînent la précipitation du sel, modifiant les conditions de fixation sur la colonne échangeuse d’anions pendant la purification. Vous pouvez savoir si le sel de l’échantillon a précipité en examinant l’aspect du culot : s’il s’agit d’un grand culot cassant au lieu d’un culot plat et brillant comme un culot d’ARN normal, il contient peut-être du sel. Les échantillons de sédiment, même lorsqu’ils proviennent de lacs d’eau douce, ont tendance à contenir du sel à cause de l’excès d’eau.

Point d’arrêt du protocole : Pour certains sols, il peut être possible de prolonger l’incubation à l’étape 12 pendant plus de 30 minutes ou même jusqu’au lendemain sans compromettre les résultats. Mais vous devez d’abord vous assurer de tester cette possibilité avec vos propres échantillons de sol.

Conseil n° 5 : Assurez-vous du bon écoulement de la colonne.

Les colonnes utilisées pour la purification finale de l’ARN sont constituées de résine tassée dans laquelle la gravité permet l’écoulement à travers la colonne. Parfois, le débit peut être très faible, parce que la résine est comprimée. Une légère application de pression positive peut permettre d’augmenter le débit des tampons et de l’échantillon à travers la colonne échangeuse d’anions.

Remarque : Si les problèmes de débit persistent, vous pouvez essayer d’utiliser le corps d’une seringue de 5 ml pour appliquer une légère pression sur la colonne et améliorer le débit. Pour ce faire, maintenez le corps de la seringue au ras de l’ouverture de la colonne. Poussez le piston de la seringue à travers la seringue, en en maintenant bien le corps contre la colonne afin que l’air ne puisse pas s’échapper par le haut. Appliquez une très légère pression, sans dépasser un débit de 1 goutte par seconde.

Conseil n° 6 : Mélangez les composants de façon appropriée.

Parfois, les solutions contenant de l’isopropanol peuvent présenter une séparation de phase si elles restent longtemps inutilisées. Pour garantir leur homogénéité, agitez les solutions SR5 et SR6 avant utilisation. Une agitation d’une durée de 10 secondes est généralement suffisante.

Conseil n° 7 : Gagnez du temps pendant l’élution.

Si vous avez déjà utilisé le kit et que vous êtes sûr des pratiques du laboratoire, vous pouvez envisager de gagner du temps en l’éluant directement dans un tube de prélèvement de 2 ml à la place d’un tube de 15 ml. Cela permet de sauter une étape de transfert et de réduire les déchets plastiques. Si vous optez pour cette méthode, la colonne d’écoulement par gravité doit être bien fixée au-dessus du tube de prélèvement placé dans un portoir.

Conseil n° 8 : Veillez à ce que la température soit appropriée pour la précipitation finale à l’isopropanol.

Après l’élution de la colonne d’écoulement par gravité, la précipitation finale est aussi réalisée à l’aide d’isopropanol (solution SR4) et incubée à -20 °C. Il est important d’effectuer cette étape à -20 °C et non à température ambiante.

Point d’arrêt du protocole : Si la préparation ne peut être terminée à temps, le protocole peut être interrompu à cette étape pour quelques heures ou jusqu’au lendemain. L’échantillon étant congelé à –20 °C, l’ARN reste stable.

Conseil n° 9 : Assurez-vous de savoir où se trouve votre culot d’ARN.

Après centrifugation pour collecter l’ARN dans l’isopropanol, le culot est normalement petit et vitreux. Veillez à orienter les tubes dans la centrifugeuse de la même manière afin de pouvoir identifier rapidement l’emplacement du culot dans tous les tubes lorsque vous décantez l’isopropanol.

Remarque : Le séchage du culot peut être accéléré en plaçant les tubes (à l’envers) sur un tissu non pelucheux dans le flux d’air de la hotte de culture tissulaire pendant qu’il est activé.

Conseil n° 10 : Prenez en compte la quantité d’eau utilisée pour la remise en suspension de l’ARN.

Une fois que vous avez obtenu un culot sec, remettez l’ARN en suspension dans un volume correspondant au volume dont vous aurez besoin pour la transcription inverse. Par exemple, si le sol recèle une forte quantité de microbes, vous pouvez resuspendre dans 50 à 100  ul d’eau. (Généralement, la concentration finale est d’environ 100 à 200 ng/ul.) Pour les sédiments et les sols secs à faible biomasse microbienne, il est préférable d’utiliser 25 ul pour que l’ARN soit plus concentré dans son utilisation ultérieure. Dans cette étape, vous avez la flexibilité de décider de la meilleure quantité d’eau pour la remise en suspension du culot.