Ajouter des marqueurs internes ou des marqueurs aux extrémités
Il existe deux méthodes de marquage d’ADN par les enzymes : aux extrémités ou en interne le long de la molécule. Des marqueurs détectables, comme des fluorophores ou des nucléotides modifiés, peuvent être introduits avec l’ajout de groupes 5’ et 3’ par action enzymatique, et avec l’introduction de marqueurs internes par intégration directe ou par des techniques de post-marquage avec une enzyme adaptée.
Stratégies d’enzyme pour l’ajout de marqueurs aux acides nucléiques
Le marquage par action enzymatique est nécessaire pour bon nombre d’études visant à comprendre les fonctions et les dynamiques des acides nucléiques in vitro et dans les cellules. Pour chaque site sur lequel des nucléotides marqués peuvent être ajoutés à l’ADN ou à l’ARN, il existe une enzyme adaptée capable de catalyser cet ajout.
| Nom du produit | DNA Polymerase I | Klenow Fragment | Klenow (3’-5’exo-) Fragment |
Mako DNA Polymerase |
T4 DNA Polymerase |
T7 DNA Polymerase |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Description | ADN polymérase mésophile |
Produit tronqué de l’ADN polymérase I d’E. coli |
Dérivé de l’ADN polymérase I d’E. coli |
Polymérase dépourvue d’activité exonucléase |
Élongation d’une matrice d’ADN liée à une amorce dans le sens 5’➞3’ |
ADN polymérase hautement processive |
| Caractéristiques | • Synthèse d’ADN 5’➞3’ |
• Polymérase 5’➞3’ |
• Polymérase 5’➞3’ |
• Pas d’activité de déplacement de brin |
• Polissage 5’ et 3’ des extrémités • Pas de déplacement de brin |
• Taux de synthèse et de fidélité de la réplication exceptionnellement élevé |
| Applications | Marquage de l’ADN par Nick Translation, synthèse d’ADNc |
Conversion des extrémités cohésives de l’ADN en extrémités franches par remplissage du surplomb en 5’, synthèse du second brin d’ADNc, séquençage et mutagenèse spécifique au site |
Adénylation des extrémités pour le séquençage nouvelle génération, amplification par déplacement de brin, marquage de l’ADN |
Séquençage | Marquage de l’ADN double brin |
Hautement processive, mutagénèse spécifique au site, synthèse du second brin d’ADNc |
| Activité exonucléase |
Activité exonucléase 3’➞5’ et 5’➞3’ |
Activité exonucléase 3’➞5’, pas d’activité exonucléase 5’➞3’ |
Dépourvu d’activité correctrice (3’➞5’) et d’activité nucléase de déplacement de brèche (5’➞3’) |
Pas d’activité exonucléase 3’➞5’ ni 5’➞3’ |
Forte activité exonucléase 3’➞5’, pas d’activité exonucléase 5’➞3’ |
Activité exonucléase 3’➞5’ |
| Prêt pour la lyophilisation, exempt de glycérol |
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Questions fréquentes (FAQ) sur le marquage d’acides nucléiques
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