初心者のためのdPCR

 dPCRの進化

今日の研究における複雑な問いに取り組むには、従来のPCR技術の能力を超えたより深い情報を必要とします。第三世代のデジタルPCRは、そのギャップを減らし、日々の研究における問いに取り組むためにますますシンプルで、そして実用的な技術になっています。

デジタルPCRの概念は、Sykesらが「限界希釈PCR」として説明した1992年より存在しています。この一般的な方法は、エンドポイント解析とポアソン分布統計を用いて、サンプル内に存在する核酸分子の絶対数を定量するものです。その後、1999年にVogelsteinとKinzlerが革新的な仕事をしました。彼らは、サンプルをパーティションと呼ばれる個別の反応液に希釈、分配し、増幅後に蛍光シグナルを示す単一の生産物を検出および解析する方法を開発しました。その後、彼らは、今日私たちの誰もが知っている「デジタルPCR」という用語を造り出しました。

長年にわたり、これらの方法は改良を重ね、商品化されて、より広く採用されるようになっています。マイクロ流体チップ、ディスク、マイクロアレイ、マイクロドロップレット、または油－水エマルションに基づくドロップレットクリスタル上で、さらに最近ではqPCR様プレートでデジタルPCRを実施できます。

デジタルPCRは、核酸の検出と定量を高感度かつ再現性高く行うための高精度なアプローチです。測定は、サンプルをパーティションに分けて行いますので、個々の反応は標的分子がゼロか1個以上存在する状態になります。各パ－ティションは、エンドポイントPCRサイクルの後に、蛍光シグナルのあり（陽性反応）／なし（陰性反応）について解析し、サンプル内の分子の絶対数を算出します。これは、サンプルの標的定量用の検量線に依存しません。検量線への依存性を取り除くことで、エラーを減らし、精度を上げます。

パーティショニングと制御

サンプルをqPCRの場合と同様に調製しつつ、サンプルを増幅前に何千という個々の反応液に分割するサンプルパーティショニングは、デジタルPCRに独特のものです。分割内に分子がランダムに分布することにより、qPCRのバルク解析とは異なり、デジタルPCRは、競合する標的の影響を最小限に抑え、希少な標的を検出する精度と感度を強化します。

これにより、次のことが可能になります。

• 定量の標的または複雑なバックグラウンドの中の標的を定量する
• 対立遺伝子の変異体（SNP）を検出・識別する
• qPCRでは検出不可能な標的レベルの小さい変化をモニターする

ポアソンの法則は分割に意味を与える

リアルタイムqPCRに反して、デジタルPCRは、各増幅サイクルに依存して標的分子の相対量を決定するのではありません。むしろ、ポアソン分布統計に依存して、エンドポイント増幅の後、標的の絶対量を決定します。

標的分子は、利用可能なすべての分割にランダムに分布しているため、ポアソン分布は、分割あたりの分子数の平均値（ゼロ、1以上）を推定し、陽性の区画あたりの標的分子のコピー数を算出します。陽性反応と陰性反応の数についてのポアソン分布の統計解析は、標的配列の正確な絶対量を割り出します。