デジタルPCRのアプリケーション

デジタルPCRで何ができますか？

デジタルPCR、特にQIAGENナノプレートベーステクノロジーは、今日の質問と回答を根本的に変えることで研究に革命をもたらし、以前はqPCRやその他のdPCRテクノロジーの制限によって妨げられていたアプリケーションに燃料を供給します。次のセクションでは、現在および新しいアプリケーションのいくつかでデジタルPCRを使用する利点について説明します。

まれな突然変異検出

希少変異検出（RMD）とは、野生型バックグラウンドのプールに非常に低頻度でのみ存在する配列変異体を検出することです（1％未満または0.1％）。したがって、点変異や一塩基多型（SNP）などのまれなイベントを検出および定量するには、高感度で正確かつ精密な方法が必要です。課題は、一方が他方よりはるかに豊富な2つの非常に類似するシークエンスを区別することです。

希少変異検出の例として、がん生検サンプル中の低頻度の一塩基変異を検出することが挙げられます。

干し草の山の中の針1本の本当の問題

液体生検で低頻度の突然変異を検出することは、干し草の山の中で針1本を見つけるようなものです。デジタルPCRは、このようなまれな分子を検出および定量し、特異的バイオマーカーの発見、早期の腫瘍検出、治療反応のモニタリングに新しい機会を提供します。簡単なワークフロー、優れた分割、独自のハイパーウェル機能を備えたナノプレートのQIAcuityデジタルPCRは、dPCRメソッドの優れた感度と精度を拡張し、非常に困難なサンプルであっても、変異体の1つのコピーを見つけることができます。

ポスターをダウンロード

コピー数多型分析

コピー数多型（CNV）分析では、個人のゲノムの特定の遺伝子のコピー数を決定します。遺伝子はゲノムごとに2つのコピーが存在することが知られています。しかし、この遺伝子は、場合によってはより多く存在することがあります。遺伝子増幅（がん遺伝子を活性化する）と欠失（がん抑制遺伝子を不活性化する）は、点変異、転座、逆位などのゲノム変化に加えて、がん関連遺伝子に影響を与える重要なコピー数変化（CNA）です。CNAの影響を受けるほとんどのがん関連遺伝子は、発がんとがんの進行に関与するがんシグナル伝達経路の重要な遺伝子と定義されています。CNV は、遺伝的多様性（遺伝子座の欠失や重複）の重要な源であり、一般的な神経疾患や自己免疫疾患、遺伝子疾患、有害な薬物反応に関連する遺伝子の研究を可能にします。

遺伝子発現解析

遺伝子発現プロファイリングは、2つ以上のサンプル間で複数の遺伝子の発現レベルを同時に比較します。この分析は、科学者が表現型の違いの分子基盤を確立し、遺伝子標的を選択し、詳細な研究を行うのに役立ちます。遺伝子発現プロファイリングでは、正常な生物学的状態と疾患における差次的遺伝子発現の役割についての貴重な洞察が得られます。

ボルバキアとキョウソヤドリコバチの相互作用の定量

キョウソヤドリコバチ（寄生バチ）体内の遺伝子発現とボルバキア存在量を定量するqPCRとdPCRのパフォーマンスを比較します。

アプリケーションノートを見る

miRNA発現解析

MicroRNA（miRNA）発現プロファイリングは、2つ以上のサンプル間で複数または単一miRNAの発現レベルを同時に比較します。この分析は、科学者ががんなどの急性疾患のバイオマーカーとしてmiRNAを特定および定量するのに役立ちます。これは、正常な生物学的状態と疾患におけるmiRNA発現の役割についての貴重な洞察を提供します。

微生物病原体検出

速度、高感度、正確度、絶対定量の組み合わせは、公衆衛生および疫学における病原体検出とマイクロバイオーム分析の両方に不可欠です。病原体とマイクロバイオームの変化の同定、検出、特性評価、モニタリングのために系統学を研究するとき、不可欠です。アプリケーション分野は、食品中の病原菌、薬剤耐性、微生物研究、抗菌薬耐性遺伝子の研究など多岐にわたります。病原体の検出では、微生物病原体は、ウイルス／細菌と宿主の関係など、ウイルスと同時に検出されることがよくあります。

ベクター媒介性疾患の同定と定量

QIAcuityデジタルPCRをqPCRと比較調査した結果、蚊が有する少量のベクター媒介ウイルスを高精度で検出および絶対定量できることが実証されています。

アプリケーションノートを見る

dPCR による下水モニタリング

病原体の存在について下水すなわち汚水をスクリーニングすることは、効果的なサーベイランスメソッドと考えられます。自然汚水は非常に不均一であり、qPCRデータは不適切なサンプル希釈や化学的汚染のために大きく変動する可能性があるため、非標的バックグラウンドの混合物からこのようなまれな標的核酸分子を特定できる方法が必要となります。 dPCRによる絶対定量は、バラツキの問題を克服し、PCR阻害剤の影響を軽減し、標準曲線の必要性を排除するため、下水サンプルからこのようなまれな分子の正確で高感度な検出を容易にします。

将来の流行を予測する

DPHLがいかにしてdPCRベースの下水ベースの疫学を採用し、地域社会におけるCOVID-19疾患有病率の全体像を把握し、公衆衛生の意思決定のために情報を提供したかご覧ください。

読む

ウイルス量定量

ウイルス量テストは、生物学的サンプル中の特定のウイルスの量を測定します。結果は、サンプル1ミリリットルあたりのウイルスRNAのコピー数として報告されます。ウイルス量テストは、急性ウイルス感染診断、治療法の選択ガイド、治療への反応モニタリングに使用します。

ヒト唾液中のSARS-CoV-2を検出するデジタルPCR

非侵襲性唾液検体中の低濃度のウイルスとその変異体を正確、高感度、高頻度で検出するqPCRに代わるものとして QIAcuity デジタルPCRの使用について説明するアプリケーションノートをお読みください。

PDFにアクセス

リキッドバイオプシー

液体生検は、リキッドバイオプシーまたは液相バイオプシーとも呼ばれ、非固形の生体組織、主に血液のサンプリングと分析を行います。主に、がんなどの疾患の診断とモニタリングのツールとして使用されます。リキッドバイオプシーは、組織生検と比較してドナーに低侵襲です。腫瘍細胞が死ぬと、 ctDNAを血中に放出します。 ctDNA のがん突然変異は、従来の腫瘍生検で見られる突然変異を反映しており、疾患追跡の分子バイオマーカーとして使用できます。課題は、血液中の腫瘍細胞由来の ctDNA の濃度が低いことです。ゴールドスタンダードは、NGS、パイロシークエンス、またはreal-time qPCRを使用することでしたが、このようなメソッドの欠点は、LODの限界でした。腫瘍組織のパイロシークエンスは約10%、NGSは 1–5%、qPCRは1%まで検出できます。そのため、検出レベルの限界によって、ドナーの病変モニタリング中に、再発の問題が生じます。

dPCRによるcfDNAの突然変異解析

この記事で紹介する「2つの力」は、大量のサンプル処理から超低頻度の突然変異検出までを可能にするワークフローで、信頼性の高い結果を生み出します。

記事を読む

GMO検出

遺伝子組み換え生物（GMO）は、一般的に遺伝子組み換え作物を指します。遺伝子工学は、ウイルス／昆虫耐性、収穫量の増加、組成の強化など、特定の望ましい形質を導入する技術を提供します。GMOの検出は、定性的（存在）または定量的（GMOの量）です。特定のGMOに固有のDNA配列の存在を検出するイベント特異的、またはGMOに挿入した外来DNA配列を検出するコンストラクト特異的のいずれかです。多くの作物生産者／輸出業者／輸入業者が規制要件を満たすには、GMOテストが必要です。現在主力のメソッドであるreal-time PCRは、複雑な食品／飼料マトリックスでよく見られる低DNAターゲットの検出と定量には限界があります。

ゲノム編集検出（CRISPR-Cas9）

ゲノム編集試験では、ジンクフィンガー（ZFN）、転写活性化因子様エフェクター（TALEN）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（CRISPR）などのヌクレアーゼを使用して、任意の細胞のゲノムを編集します。このようなヌクレアーゼは、部位特異的DNA二本鎖切断（DSB）を行い、これは不正確でエラーが発生しやすい非相同末端結合（NHEJ）（ドナーテンプレート／正確な点突然変異）または、標的突然変異誘発につながる経路である相同性指向修復（HDR）（欠失／インデル／挿入）によって修復できます。その結果、不均一なインデルエラーとさまざまな対立遺伝子編集頻度を持つ細胞の混合集団が発生します。次に、目的の遺伝子座のゲノム編集頻度を測定します。クローン細胞株は単一細胞を分離し、それをアッセイしてゲノム編集イベントを検証します。

NGSライブラリーの定量と検証

NGSライブラリーの定量と検証は、現在さまざまな方法で実行されています。分光光度計および蛍光光度計システムとqPCRの使用では、生成したライブラリーの正確な定量には制限があります。ライブラリーの正確な濃度は、費用対効果が高く正確なシークエンシングに重要です。Real-time PCRはこれまで、シークエンシングランの検証のためのゴールドスタンダードとなっています、欠点は、NGSの結果を1％未満で検証する必要がある場合に、精度に欠けることです。

dPCRとNGS：併用したほうがよいでしょうか？

2つのテクノロジーについて、その利点、限界、相補性、NGSライブラリーの定量にdPCRを使用する方法をご紹介します。

残留宿主細胞DNAの定量

残留宿主細胞DNA（HCD）は、治療用タンパク質とワクチンの製造プロセス中に持ち込まれます。許容レベルは、米国食品医薬品局や世界保健機関などの規制当局によって確立されています。デジタル残留DNA定量キットは、複雑なバイオプロセスにおけるHCDの高精度の定量に最適です。遺伝子治療、細胞ベースのワクチン、同様の生物学的治療薬などの開発中に除去される細胞にはHEK293、CHO、 E. coliがあります。

細胞および遺伝子治療のリスクを回避する方法

適切に設計されたデジタルPCRアッセイが、どのようにして品質管理を次のレベルに引き上げ、より安全なバイオマニュファクチャリングを可能にしているのかご覧ください。