scientist working on a computer
デジタルPCR

dPCR対qPCR

dPCRテクノロジーとqPCRテクノロジーを比較すると、主な違いは精度です。どちらも高感度で信頼性の高い核酸の検出と定量を提供しますが、2つのテクノロジーの主な違いは、アナログ無線を使用しているかデジタル無線を使用しているかで最もよく説明できるのだと、国立測定研究所の主任研究員Dr. Jim Huggettが述べています。「アナログ無線では、干渉が最小限で、目的のステーションに合うように、最初にダイヤルを微調整する必要があります。それでも、品質は受信に依存し、信号は静電気の干渉を受けます。それがqPCRです。信頼性はありますが、良い結果を得るには最適化が必要であり、それでも、バックグラウンドノイズに対処する必要があります。デジタル無線を使用すると、ステーションを呼び出すだけです。クリアな信号でステーションがあるかないかのどちらかです。後者はdPCRと同様に、正確なバイナリ結果を提供します。文字通りDNA分子の有無を数えます。結果の明瞭さと低いエラー率により、信じられないくらい高レベルの精度が得られます。デジタルPCRは、小さな量的差の測定に適しています。」

比較対照:qPCRとdPCR

研究者は、qPCRの速度、感度、特異性、使いやすさを高く評価しています。この技法は、遺伝子発現解析、病原体検出、マイクロバイオーム解析、マイクロアレイデータ検証に最も有用です。しかし、コピー数多型分析、突然変異やSNPの検出、対立遺伝子の識別など、優れた精度と感度を必要とするアプリケーションでは、qPCRは弱体化することがわかりました。このようなアプリケーションでは、dPCRは、絶対コピー数測定だけでなく、検出限界を克服することでqPCRよりも優れています。つまり、10%の精度と1%未満の突然変異率で表される小さな発現差を検出します。

デジタルPCRは、定量が堅実、すなわちPCR阻害物質に対して高い耐性を示し、サンプルの分割とエンドポイントサイクリングによるPCR効率の変化の影響もあまり受けません。

real-time PCR/qPCR デジタルPCR
定量的、相対的、または絶対的だが標準
曲線またはリファレンスサンプルが必要
定量的、絶対的および非標準または
リファレンスが必要

バルクPCR

  • 柔軟な反応量
  • 指数増殖期にデータを収集するので
    、PCR効率の変化の影響を受ける
  • 阻害物質の影響を受けやすい

サンプル分割

  • 高い阻害物質
    耐性/確実性の向上
  • 増幅効率の
    変化の影響を受けない
  • ポアソン統計の対象となる
    高い統計的検出力
各サイクルでPCR増幅を測定 PCRサイクル終了時に測定
1%を超える突然変異率検出率 突然変異率検出率≥0.1%(高い
シグナル対ノイズ比)
確立されたプロトコール 高精度でラボ間の
高い再現性

qpcr vs dpcr heparin
dPCR反応は、フミン酸やヘパリンなどの阻害物質が存在する場合でも堅実なままです。qPCR(Rotor-Gene Q使用)およびdPCR(QIAcuity使用)反応は、それぞれのQIAcuity PCRマスターミックス(EvaGreen)および同じ反応量を使用して、指示量の阻害物質存在下で実行しました。定量では、Cq(qPCR)またはコピー/µl(dPCR)が、非阻害サンプルを100%に設定したサンプル間の相対的な性能の差として示されます。
digital pcr vs qpcr humic acid
dPCR反応は、フミン酸やヘパリンなどの阻害物質が存在する場合でも堅実なままです。qPCR(Rotor-Gene Q使用)およびdPCR(QIAcuity使用)反応は、それぞれのQIAcuity PCRマスターミックス(EvaGreen)および同じ反応量を使用して、指示量の阻害物質存在下で実行しました。定量では、Cq(qPCR)またはコピー/µl(dPCR)が、非阻害サンプルを100%に設定したサンプル間の相対的な性能の差として示されます。
qpcr vs dpcr precision
精度50%を表すqPCRの1 Cqは、dPCRでは精度10%に相当し、濃度増加2倍に相当します。

いつ dPCR またはqPCRを使用しますか?

核酸定量に関連する分子生物学やゲノミクス研究に関して、科学者たちはしばしば、自分たちが岐路に立っていることに気づきます。研究目標を効率的に達成するために選択すべき定量技法は何か、より正確で堅実なデジタルPCR(dPCR)か、それともより標準化され、使い慣れた定量real-time PCR(qPCR)か。両テクノロジーには類似点がありますが、アプリケーションに依存して選択を行う利点と制限もあります。

アプリケーショングリッドに、いくつかの一般的なアプリケーションに対する各テクノロジーの適合性レベルを示します。

ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)は、デジタルPCRの最も初期の形態の1つであり、上記アプリケーションのほとんどで、すでにqPCRを超える利点を提供できる可能性があります。ddPCRとqPCRの比較で、qPCRは広いダイナミックレンジを必要とするアプリケーションに適しており、ddPCRはより高い精度や分画の存在量分析が必要なアプリケーションに適しています。

ddPCRからナノプレートdPCRへの進化により、この技術の範囲はさらに広くなり、より多くのアプリケーションが含まれるようになりました。ナノプレートdPCRワークフローは、すべてのサンプルパーティションの同時読み取り、フロントエンドの自動化、qPCRのような容易なプレートセットアップにより、大幅に高速化されています。このスピードアップにより、精度、正確さ、感度を損なうことなく、スクリーニングやハイスループットのアプリケーションに適するようになりました。

dPCRに何ができるかご覧ください
デジタルPCR、特にQIAGENナノプレートベースのテクノロジーは、今、答えることができる質問を根本的に変え、幅広いアプリケーションを可能にします。
最先端のdPCRテクノロジーで研究者を指導
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BioXpediaの創設者兼CEOであるMogens Kruhøfferは、患者の利益のために、アイデアから臨床まで研究を加速する技術の進歩の可能性を認識しています。ラボに最近追加されたQIAcuityにより、お客様により良い結果をより迅速に提供できるようになります。
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dPCRでマラリア疫学コードを解読する
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Dr. Wang Nguitragoolは、qPCRからdPCRに切り替えることにより、自分たちの標準的なアッセイでは同定できなかったいくつかの未知のサンプルを同定できるようになりました。
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dPCRを使用して肥満の背後にある遺伝的特徴を特定する
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Dr. Johanna Andersson-Assarssonは、dPCRを使用して、qPCRでは解像度が十分ではなかった多数のコピーを持つ非常に可変的な肥満遺伝子の正確なコピー数を決定しました。
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デジタルPCRは、突然変異しているCOVID株を明らかにする
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下水のCOVID-19研究が、RT-qPCRやDNAシークエンシングなどのメソッドに固有の技術的問題によって妨げられたとき、このフランスのスタートアップ企業の研究者はdPCRに切り替えました。これにより、突然変異株を早期かつ確実に検出できだだけでなく、 下水で検出されたSARS-CoV-2の量と感染した集団を関連付けることができたのでした。
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2021年のAPHL dPCR助成金受領者

テネシー州保健局のベクター媒介性疾患プログラムのディレクターであるDr. Abelardo Moncayoは、APHLと共同でQIAGENのデジタルPCRテクノロジーアクセス助成金の2021年受領者です。博士が、蚊やダニに対する研究とサーベイランス戦略の指導にデジタルPCRをどのように使用するつもりなのかお聞きください
初心者向けdPCRガイド
このようなリソースは、dPCRへの切り替えを検討し、最初の実験を計画しているすべての人に貴重なガイダンスを提供するように設計されています。
QIAGENのQIAcuityシステムを使用するデジタルPCR:はじめに
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デジタルPCRのヒントとコツ
ゲストウェビナーからの洞察に満ちた回答と、上位20個の質問をまとめましたのでご覧ください。
dPCRで使用するアッセイは、qPCRで使用するアッセイとはどのように異なりますか?
適切なreal-time PCRアッセイ設計のすべての規則は、 dPCRにも適用されます。real-time PCRでうまく機能するアッセイは、 dPCRでもうまく 機能する可能性があります。SYBRアッセイは、 EvaGreen dPCRに簡単に転送できます。ただし、それぞれの QIAcuity dPCR キットで概説しているように、 dPCRに、推奨 サイクリング条件とプライマー/プローブ濃度を選択するように注意する必要があります。たとえば、アニーリングステップ中に温度勾配を実行することにより、最適ではない実行アッセイを 迅速に最適化するために、 QIAcuity マスターミックスを任意のreal-time PCR装置で実行することもできます。より 詳細なアッセイ設計ガイダンスについては、 QIAcuity アプリケーションガイド をご参照ください。
qPCRとdPCRの違いは何ですか?

qPCRとdPCRの違いは、核酸の定量方法です。qPCRは、増幅が生じたときに増幅を測定し、標準曲線を用いてサンプル中の核酸量を決定します。dPCRは、サンプルを数千のパーティションに分け、各反応終了時にデータを収集し、統計学を用いて各反応の分子の絶対数を取得します。

デジタルPCRとRT qPCRの違いは何ですか?
デジタルPCRとRT qPCRの違いは、定量方法です。どのRT-PCRでも、RNAサンプルをcDNAに逆転写し、その後、これをPCR反応で増幅します。RT-qPCRでは、標準曲線を用いてcDNAをリアルタイムで定量します。RT-dPCRでは、反応終了時にcDNAを測定し、ポアソン統計を用いて絶対定量を行います。両方の方法を使用して、RNAと遺伝子発現を分析できます。
dPCRに標準曲線は必要ですか?
dPCRでは、エンドポイント反応のターゲットの絶対濃度を測定します。未知物質の濃度は、観察したdPCRの結果(陰性の数、陽性の数、分析したパーティション量)に基づいて決定できます。
qPCRと比較したデジタルPCRの利点は何ですか?
dPCRは検量線を必要とせず、検量体とサンプルの違いに影響されないため、qPCRよりもデジタルPCRの方が好まれることがよくあります。デジタルPCRはPCR効率が高く、非常に正確で、非ターゲットDNAのバックグラウンドが高い中で希少ターゲットを検出するのに適しています。また、dPCRはqPCRに比べてPCR阻害剤に対する感度が低くなります。
qPCR は何に使用されますか?

qPCRは、希少変異(ctDNA)、希少なシークエンス(ウイルスや細菌量、miRNA)、コピー数多型の検出、遺伝子発現の定量、SNP遺伝子型決定、マイクロアレイの検証、アッセイの検証、病原体の検出、NGSライブラリの定量などに使用されます。

qPCRとはどのようなもので、どのように機能するのですか?
定量的PCR(qPCR)は、核酸を定量する方法のひとつです。qPCRは、蛍光のモニタリングを通じてDNAの増幅をリアルタイムで測定することによって機能します。ある時点で、蛍光強度は、サンプル中のテンプレート核酸の最初の数に比例して増加します。ターゲットDNAの量は、濃度が既知の標準物質を段階希釈して作成した検量線を用いて計算します。
qPCRの欠点は何ですか?
qPCRの欠点は、この方法が標準曲線に依存していることです。このような曲線が必要なため、時間とリソースがかかり、PCRの効率に悪影響を及ぼします。qPCR法はdPCRに比べ、精度、再現性が低く、PCR阻害物質や汚染物質に対する感度が高くなります。
最適化の目的で、qPCRサイクラーでdPCRマスターミックスを使用できますか?
dPCRマスターミックスをqPCRで使用して、qPCRからdPCRにアッセイを転送する前に、サンプル濃度やプライマー/プローブ濃度を最適化できます。