초보자를 위한 dPCR

dPCR의 진화

오늘날의 복잡한 연구 목적에는 기존 PCR 기술의 용량을 넘어서는 심도 있는 정보가 필요합니다. 3세대 디지털 PCR은 이러한 격차를 줄이고 이러한 일상적인 연구 목적을 다루는 훨씬 간단하고 실용적인 기술이 되고 있습니다.

디지털 PCR의 개념은 1992년 Sykes et al.이 "제한 희석 PCR"로 기술한 후부터 존재해 왔습니다. 이 일반적인 방법은 검체에 존재하는 핵산 분자의 절대 수를 정량화하기 위해 종말점 분석 및 푸아송 통계를 사용했습니다. 그 후, 1999년 Vogelstein과 Kinzler의 혁신적인 작업으로, 검체를 희석하여 분획이라고 하는 개별 반응에 분배하고, 증폭 후 형광 신호가 있는 단일 산물을 검출하고 분석하는 방법을 개발했습니다. Vogelstein과 Kinzler가 오늘날 우리 모두가 알고 있는 "디지털 PCR"이라는 용어를 사용했습니다.

수년에 걸쳐 이러한 방법은 더 널리 채택될 수 있도록 혁신되고 상업화되었습니다. 미세유체 칩 및 디스크, 마이크로어레이 및 미세 방울 또는 유수 에멀젼을 기반으로 하는 방울 결정에 대해 디지털 PCR을 수행할 수 있으며, 더 최근에는 qPCR 유사 플레이트에서 수행할 수 있습니다.

디지털 PCR은 민감성 있고 재현성 있는 핵산 검출 및 정량화를 위한 매우 정밀한 방법입니다. 검체를 분획으로 나누어 측정을 수행하므로 개별 반응에는 표적 분자가 없거나 하나 이상 있습니다. 종말점 PCR 사이클링 후 형광 신호 존재(양성 반응) 또는 부재(음성 반응)에 대해 각 분획물을 분석하고, 검체 내 존재하는 분자의 절대 수를 계산합니다. 디지털 PCR은 검체 표적 정량화에 있어 표준 곡선에 의지하지 않습니다. 표준 곡선에의 의존을 하지 않음으로써 오류가 줄어들고 정밀도가 높아집니다.

나누어 정복하기

검체는 qPCR에서와 마찬가지로 준비하지만, 증폭 전에 검체를 수천 개의 개별 반응으로 나누는 검체 분획은 디지털 PCR에 고유합니다. qPCR의 대량 분석과 달리 분자를 분획으로 무작위로 분배함으로써 디지털 PCR은 표적 경쟁의 영향을 최소화하고 희귀 표적 검출의 정밀도와 민감도를 향상합니다.

이를 이용하여 연구자들이 다음을 할 수 있습니다.

• 존재도가 낮은 표적 또는 복잡한 배경의 표적 정량화
• 대립유전자 변이체(SNP) 검출 및 식별
• qPCR로 검출할 수 없는 표적 수준의 작은 변화 모니터링

푸아송의 법칙은 분획에 의미를 부여합니다

Real-time qPCR과 달리 디지털 PCR은 표적 분자의 상대적인 양을 결정하기 위해 모든 증폭 주기에 의존하지 않습니다. 대신, 푸아송 통계에 의존하여 종말점 증폭 후 절대적인 표적 양을 결정합니다.

표적 분자가 사용 가능한 모든 분획에 무작위로 분포되기 때문에 푸아송 분포는 분획당 평균 분자 수(0, 하나 이상)를 추정하고 양성 분획당 표적 분자의 사본 수를 계산합니다. 양성 및 음성 반응의 수에 대한 푸아송 통계 분석으로 표적 시퀀스의 정밀하고 절대적인 정량을 산출합니다.