클로닝 및 DNA 재조합

점착(sticky) 또는 평활(blunt): 변형, 어닐링, 연결

클로닝 및 DNA 재조합 기술은 건강과 질병에 있어서 유전자 및 세포의 작용에 대한 많은 통찰력을 제공했습니다. 이제 클로닝 기술과 응용 기술은 조합 라이브러리의 높은 처리량 어셈블리 및 후성유전학적 변형 매핑과 같은 혁신적인 응용 기술을 통해 더욱 발전했습니다.

클로닝용 효소

적합한 플라스미드 벡터로 템플릿 DNA를 복제하기 전에 말단 변형이 필요할 수 있습니다. 클로닝을 위해 확인된 DNA는 일반적으로 제한 효소 분해 또는 PCR 증폭을 통해 공급원에서 얻게 됩니다. Klenow Fragment, T4 DNA 중합 효소, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 같은 특수 효소는 DNA 단편과 벡터 사이의 공유 결합을 개선하기 위해 3’ 또는 5’ 말단을 변형합니다.

다음 클로닝 단계는 벡터와 인서트의 말단을 어닐링하는 데 적합한 효소를 사용한 라이게이션입니다.

테일링은 일반적으로 TA 클로닝에 사용할 T-벡터를 준비하거나 TA 클로닝에 사용할 고성능(high-fidelity) 중합효소(Taq 아님)에 의해 생성된 PCR 제품을 A-테일링하기 위해 수행됩니다. Taq DNA 중합효소로 증폭한 산물은 이미 A-테일링 되어 있습니다.

DNA 말단 변형용 효소

효소	말단 변형
	말단 fill 5’→3’	말단 fill 3’→5’	클로닝을 위한 A-테일링	말단 5’ 인산화
P7060L Klenow Fragment 출시 예정	✔ 예	✔ 예	✘ 아니요	✘ 아니요
P7080L T4 DNA Polymerase*	✔ 예	✔ 예	✘ 아니요	✘ 아니요
P7010 Klenow(3’→5’ exo-)	✘ 아니요	✘ 아니요	✔ 예	✘ 아니요
Y9040L T4 Polynucleotide Kinase	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요	✔ 예
Y9140† End Repair Mix	✔ 예	✔ 예	✘ 아니요	✔ 예

DNA 라이게이션용 효소

효소	라이게이션
	점착 말단 라이게이션	평활 말단 라이게이션	닉 (nick) 밀봉
*L6090L E. coli* DNA Ligase** 출시 예정	✔ 예	✘ 아니요	✔ 예
L6010L T3 DNA Ligase 출시 예정	✔ 예 A/T > G/C [1.0 M NaCl]	✔ 예	✔ 예
L6030 T4 DNA Ligase 출시 예정	✔ 예	✔ 예	✔ 예
EN11 T4 DNA Ligase BLIRT	✔ 예	✔ 예	✔ 예
L6020L T7 DNA Ligase 출시 예정	✔ 예	✘ 아니요	✔ 예
EN13 Tth DNA Ligase*	✔ 예	✘ 아니요	✔ 예
L6060L Taq DNA Ligase^†출시 예정	✘ 아니요	✘ 아니요	✔ 예

클로닝을 위한 SLIC 방법

염기서열 및 라이게이션 독립 클로닝(Sequence and Ligation Independent Cloning, SLIC)은 엑소뉴클레아제 효소 활성을 이용합니다.

차세대 염기서열 분석을 위한 클로닝

차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리는 단편화된 DNA로 시작됩니다. 효소 작용으로 클로닝 단계가 완료됩니다.

icon-genomics평활(blunt) 단편
말단이 평활화되고 효소인 T4 DNA 중합효소, Klenow Fragment, T4 PNK로 5’ 인산화됩니다.
icon-bio-informaticsA-꼬리 말단
다음으로, 이 효소 중 하나를 사용하여 3’ 말단을 A-꼬리로 만듭니다. Taq DNA 중합효소 또는 Klenow Fragment(3’→5’ exo-).
icon-barcode어댑터 추가
그런 다음 최종 효소인 T4 DNA 리가아제로 라이게이션하여 보완 어댑터 또는 바코드를 추가합니다.

DNA 라이브러리 구축에 필요한 모든 효소 구성 요소는 어댑터를 사용하여 '자가 제작(home-brew)' 라이브러리 준비 키트로 조합할 수 있습니다.

유전자 합성

유전자 합성은 상보적으로 겹치는 긴 영역을 가진 올리고데옥시뉴클레오티드를 결합하는 것을 기반으로 합니다.

icon-temperature열 안정성 Taq DNA 리가아제
T4 DNA 리가아제 대신 열에 안정한 Taq DNA 리가아제를 사용하여 합성을 개선합니다.

라이게이션 온도가 높을수록 올바른 라이게이션 생성물을 형성할 확률이 높아집니다.
icon-target닉(nick) 선택적 리가아제

갭을 가로지르는 라이게이션으로 인한 결실을 방지하려면 닉(nick) 선택적 리가아제를 사용합니다.

길게 합성된 DNA는 순서 없이 결합되지 않습니다.

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클로닝 및 재조합용 효소에 대한 FAQ

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