클로닝 및 DNA 재조합

E. coli DNA 중합효소 I의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성은 다수의 응용 기술에 적합하지 않습니다. Klenow Fragment는 5'→3' 중합효소와 3'→5' 프루프리딩 엑소뉴클레아제를 포함하는 큰 도메인입니다. Klenow Fragment는 이러한 활성이 부족하며, 단일 가닥 템플릿에서 이중 가닥 DNA 합성, 5' 오버행 평활화를 위해 DNA 단편의 오목한 3' 말단 필링(filling), 돌출된 3' 오버행 분해, 라벨링된 DNA 프로브 준비 등 유용한 연구 응용 기술에 사용됩니다. 

E. coli DNA 중합효소 I의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 바람직하지 않을 수 있는 것처럼, Klenow Fragment의 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성도 특정 응용 기술에서 바람직하지 않을 수 있습니다. 이 문제는 5'→3' 중합효소 활성은 유지하지만 엑소뉴클레아제 활성이 없는 Klenow Fragment(3'→5' exo-) 효소를 생성하는 돌연변이를 도입함으로써 극복할 수 있습니다. Klenow Fragment(3'→5' exo-)는 마이크로어레이의 일부 형광 라벨링 반응과 차세대 염기서열 분석을 위한 DNA 라이브러리 준비에 자주 사용되는 DNA 어댑터를 DNA 단편에 결합하는 과정의 중요한 단계인 dA 및 dT 테일링에 사용됩니다

T4 페이지의 DNA 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I, Taq DNA 중합효소, 미토콘드리아 DNA 중합효소를 포함하는 중합효소 패밀리 A의 일부입니다. T4 DNA 중합효소는 라벨링 된 5’-오버행 또는 라벨링되지 않은 dNTP 또는 3'-오버행이 있는 DNA 분자에서 평활(blunt) 말단을 생성하는 데 효과적으로 사용할 수 있습니다. T4 DNA 중합효소는 템플릿 의존적이며 프라이머가 필요하고 5’→3’ 엑소뉴클레아제 기능이 없습니다. T4 DNA 중합효소는 라이게이션과 무관하게 PCR 제품의 복제에 사용할 수 있습니다. 

라이게이션 독립 클로닝(Ligation Independent Cloning, LIC)은 제한 효소/리가아제 클로닝의 대체 기술입니다. 인서트는 PCR로 증폭되고 벡터는 제한 효소 분해 또는 PCR로 선형화됩니다. LIC는 T4 DNA 중합효소의 3’→5’ 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 벡터와 인서트 사이에 상보성을 가진 오버행을 생성합니다. 원스텝 염기서열 및 라이게이션 독립 클로닝(Sequence and Ligation Independent Cloning. SLIC)에서는 선형화된 벡터와 PCR 증폭 인서트를 단일 튜브에 혼합하고 T4 DNA 중합효소로 처리합니다. 혼합물을 얼음 위에서 인큐베이션하여 반응을 멈추고, 컴피턴트(competent) E. coli 세포에 혼합물을 투입한 후 갭과 오버행을 복구합니다.

T4 DNA 리가아제는 실험실 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 다용도 리가아제로, 이 효소는 DNA와 올리고뉴클레오타이드의 응집성 또는 평활(blunt) 말단을 모두 라이게이션할 수 있기 때문입니다. T4 DNA 리가아제는 이중 DNA의 단일 가닥 닉(nick)을 복구할 수 있지만 단일 가닥 핵산을 라이게이션하지는 못합니다. T4 DNA 리가아제는 RNA 분자가 RNA:DNA 혼성에 있을 때 결합합니다. 점착성 DNA 말단을 12–16°C에서 T4 DNA 리가아제로 라이게이션하면 효소 활성과 어닐링된 DNA 오버행의 안정성 사이에 균형을 유지할 수 있습니다. T4 DNA 리가아제는 65°C에서 10분간 인큐베이션하여 열 불활성화할 수 있습니다.