분석 및 검출용 효소

T7 DNA Polymerase 자체는 진행도(processivity)가 낮습니다. 15nt 미만의 결합 후 프라이머–템플릿으로부터 해리됩니다. E. coli에 감염되면 T7 파지는 숙주 단백질인 티오레독신에 부착되어 진행도(processivity) 인자로 작용합니다. T7 DNA polymerase 및 티오레독신이 일대일 복합체로 결합하고 T7 DNA polymerase에 티오레독신이 결합하면 특히 프라이머–템플릿에 대한 중합효소의 친화력이 80배 증가합니다. 프라이머–템플릿 친화력 증가 결과 T7 DNA polymerase가 해리되지 않고 단일 가닥 DNA의 프라이머를 수천 개의 뉴클레오티드로 연장하여 DNA를 연속적으로 길게 합성할 수 있게 합니다. T7 DNA polymerase는 잔여 유전체 DNA를 제거하여 공유 결합한 원형 DNA를 정제하고 상보적 cDNA 가닥을 합성할 수 있습니다. 

또 다른 응용은 이중 가닥 DNA에 존재하는 닉(nick)을 라벨링하여 세포사멸 단편 DNA를 in situ 검출하는 것입니다. 높은 진행도(processivity), 강력한 3’→5’ 엑소뉴클레아제 활성, 다양하게 태그된 뉴클레오사이드 삼인산염을 견딜 수 있는 능력은 DNA 손상의 in situ 라벨링에 T7 DNA polymerase를 적용하는 데 가장 중요한 특성입니다.

체내 comet 분석은 OECD 검사 지침에 따라 확립된 유전독성 검사입니다. 일반적인 형태에서는 가닥 단절과 알칼리 취약 부위로 DNA 손상을 검출합니다. DNA가 병변 특이적 효소와 함께 배양되는 분석의 추가적인 단계를 포함하면 DNA 손상의 특정 성격에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

복구 분석 대부분의 응용은 인간 생체 모니터링입니다. 매일 인류는 직업적 및 환경적으로 돌연변이 유발 및 발암성 화합물에 노출됩니다. 직업적 노출의 측면에서, 몇몇 직업에서 사람들은 유전독성/돌연변이 유발 화합물에 노출됩니다. 예를 들면 살충제, 염모제, 포름알데하이드, 항암제, 유기 용매 등이 있습니다.

Comet 분석 기술은 단일 뉴클레오이드(세포 용해 및 히스톤 제거 후 핵 기질에 부착된 DNA) 전기영동을 기반으로, 슈퍼코일링을 느슨하게 하고 단절이 포함된 DNA 고리의 이주를 허용하는 단절 빈도에 따라 꼬리의 농도가 달라지는 혜성 같은 이미지를 제공합니다. 병변 특이적 엔도뉴클레아제로 뉴클레오이드를 분해하면 다른 DNA 병변을 검출할 수 있습니다.

E. coli에서 유래한 Endonuclease VIII(Endo VIII)은 티민 글리콜과 요소를 포함한 티민의 방사성 산물을 포함하여 광범위하게 산화적 손상을 입은 피리미딘 염기를 제거하는 역할을 합니다. 이 효소는 이러한 종류의 DNA 손상을 찾기 위해 comet 분석에 사용됩니다. Endo VIII은 염기 절제 수리(BER) 경로에서 작동하여 N-glycosidic 결합의 가수분해를 촉매합니다(N-glycosylase 활성). 결과적으로 변형된 자유 염기 및 apurinic/apyrimidinic (AP) 부위가 형성됩니다. AP 부위의 순차적인 절단은 β, δ-제거(AP-lyase 활성)를 통해 진행되고 단일 가닥 DNA 단절을 생성합니다. 분석은 그 단절을 감지하고, 병변이 식별됩니다.

Endo VIII의 DNase I footprint 분석은 DNA에 결합하는 단백질이 주로 손상이 포함된 가닥에 접촉 부위가 있는 작은 footprint임을 보여줍니다.