핵산 라벨링용 효소 | 내부 마커 또는 말단 라벨링

말단에 내부 마커 또는 라벨 추가

효소 DNA 라벨링에는 분자 말단 또는 분자 내부에 라벨링하는 두 가지 방법이 있습니다. 형광단 또는 변형 뉴클레오티드와 같은 검출 가능한 마커는 효소 작용을 통해 5’ 및 3’기를 추가하여 도입할 수 있을 뿐만 아니라 적절한 효소를 직접 결합하거나 사후 라벨링 기술을 통해 내부 마커를 도입할 수도 있습니다.

핵산에 라벨을 추가하기 위한 효소 전략

체외 전사

변형된 뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 다양한 조합으로 혼합됩니다
Taq DNA 중합효소와 같은 일부 효소는 PCR을 통해 직접 라벨링된 뉴클레오티드를 결합할 수 있습니다
랜덤(Random) 프라이머 라벨링은 Klenow Fragment에 의한 5'→3' 중합반응을 활용하여 라벨을 결합합니다
RNA 중합효소는 체외 전사 중에 라벨링된 뉴클레오티드를 직접 결합할 수 있습니다

닉(nick) 번역

템플릿을 DNase I으로 처리하면 가닥에 닉(nick)이 생깁니다
니킹(nicking) 작용은 라벨링되지 않은 DNA 내에서 3'-수산기를 떨어지게 합니다
DNA 중합효소 I은 닉(nick)의 3'-수산기 말단에 뉴클레오티드 잔기를 추가합니다
닉(Nick) 번역은 변형된 dNTP 기질로 DNA 잔기의 최대 50%까지 라벨링할 수 있습니다

합성 또는 이동을 통한 말단 라벨링

T7 DNA 중합효소와 같은 일부 효소는 DNA의 5’ 말단에 라벨링된 뉴클레오티드를 추가할 수 있습니다
말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)는 DNA의 3' 수산기 말단에 라벨링된 dNTP를 추가합니다
폴리(A) 중합효소는 RNA의 3’ 말단에 라벨링된 뉴클레오티드를 추가할 수 있습니다
폴리뉴클레오티드 키나아제(Polynucleotide Kinase, PNK)의 효소 작용으로 핵산의 5’ 말단에 라벨링된 인산염이 추가될 수 있습니다

효소 작용에 의한 라벨링은 체외 및 세포 내 핵산의 기능과 역학을 규명하려는 많은 연구에 필요합니다. 라벨링된 뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA에 추가될 수 있는 모든 부위에는 추가를 촉매할 수 있는 적절한 효소가 있습니다.

효소	작용	라벨링 작용
		말단 라벨링	직접 결합	랜덤(Rnadom) 프라이밍 방식	갭 라벨	닉(nick) 번역
P7060L Klenow Fragment 출시 예정	5’→3’ 합성 및 3’→ 5’ 엑소뉴클레아제 활성을 가진 DNA 중합효소	✘ 아니요	✔ 예	✔ 예	✘ 아니요	✘ 아니요
P7010 Klenow(3’→5’ exo-)	5’→3’ 합성 활성을 가진 DNA 중합효소	✔ 예(3’ dsDNA)	✔ 예	✔ 예	✘ 아니요	✘ 아니요
P7260L T7 DNA polymerase 출시 예정	5’→3’ 합성 및 3’→5’ ssDNA 및 dsDNA 엑소뉴클레아제 활성을 가진 DNA 중합효소. [이중 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성에는 티오레독신의 존재가 필요합니다.]	✔ 예(5’ dsDNA)	✔ 예	✘ 아니요	✔ 예	✘ 아니요
P7050L DNA polymerase I	5’→3’ 합성, 5’→3’ 및 3’→5’ 엑소뉴클레아제 활성을 가진 DNA 중합효소	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요	✔ 예
RP810 TaqNova Stoffel DNA Polymerase BLIRT	5’→3’ 엑소뉴클레아제가 결핍된 Taq DNA 중합효소의 Stoffel Fragment 유도체	✘ 아니요	✔ 예	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요
P7620L TaqIT DNA polymerase 출시 예정	TaqIT는 Taq DNA 중합효소(Stoffel)의 5’→3’ 엑소뉴클레아제 결핍 유도체입니다	✘ 아니요	✔ 예	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요
P7070L Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 출시 예정	DNA 분자의 3' 수산기 말단에 dNTP를 추가하는 것을 촉매하여 평활(blunt) 5’-오버행 ssDNA 및 RNA를 연장합니다	✔ 예(3’ ssDNA)	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요
P7180L T7 RNA polymerase 출시 예정	DNA 템플릿의 5’→3’ 방향으로 RNA 합성	✘ 아니요	✔ 예(RNA)	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요
P7460L Poly (A) polymerase 출시 예정	폴리(A) 꼬리 RNA를 위해 ATP에서 RNA의 3’ 수산기에 AMP를 추가하는 것을 촉매합니다	✔ 예(3’ RNA)	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요
L6050L T4 RNA ligase 1 출시 예정	RNA와 ssDNA 분자를 라이게이션합니다	3’(RNA 및 ssDNA)	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요
Y9040L T4 polynucleotide kinase (PNK)	γ-인산염을 ATP에서 폴리뉴클레오티드의 5´-말단 또는 5´-수산기를 갖는 단일 뉴클레오티드로 옮기는 것을 촉매합니다	5’(ssDNA, dsDNA, RNA)	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요	✘ 아니요

핵산 라벨링을 위한 주요 효소 알아보기

주요 제품 (4)

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핵산 라벨링에 대한 FAQ

polA 유전자로 코딩된 DNA 중합효소 I은 최초로 발견된 DNA 중합효소이며 E. coli에서 가장 풍부한 중합효소입니다(세포당 약 400분자). 이것은 단일 가닥 템플릿을 방출하지 않고 여러 중합반응 단계를 순차적으로 촉매할 수 있다는 점에서 가공 효소(processive enzyme)의 한 예입니다. 폴리펩티드는 5'→3' 중합효소와 3'→5' 프루프리딩 엑소뉴클레아제를 포함하는 큰 도메인(Klenow Fragment)과 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 작은 단편이라는 두 가지 기능 도메인을 가지고 있습니다. 후자의 활성은 DNA 중합효소 I이 다운스트림 오카자키 단편을 시작하는 데 사용되는 RNA 프라이머를 제거할 수 있게 해줍니다. 체내에서 중합효소의 주요 기능은 재조합과 DNA 복구에 참여하는 것입니다. DNA 복구 과정에서 DNA 중합효소 I은 DNA 병변 제거로 인해 생긴 DNA 갭을 메웁니다.

연구 응용 기술에는 DNase I 의존적 닉(nick) 번역, cDNA 클로닝의 두 번째 가닥 합성, 5´ 오버행 필인(fill-in) 등이 있습니다. DNA 중합효소 I은 비오티닐화된 뉴클레오티드를 결합합니다.

E. coli DNA 중합효소 I의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성은 다수의 응용 기술에 적합하지 않습니다. Klenow Fragment는 5'→3' 중합효소와 3'→5' 프루프리딩 엑소뉴클레아제를 포함하는 큰 도메인입니다. Klenow Fragment는 이러한 활성이 부족하며, 단일 가닥 템플릿에서 이중 가닥 DNA 합성, 5' 오버행 평활화를 위해 DNA 단편의 오목한 3' 말단 필링(filling), 돌출된 3' 오버행 분해, 라벨링된 DNA 프로브 준비 등 유용한 연구 응용 기술에 사용됩니다.

E. coli DNA 중합효소 I의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 바람직하지 않을 수 있는 것처럼, Klenow Fragment의 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성도 특정 응용 기술에서 바람직하지 않을 수 있습니다. 이 문제는 5'→3' 중합효소 활성은 유지하지만 엑소뉴클레아제 활성이 없는 Klenow Fragment(3'→5' exo-) 효소를 생성하는 돌연변이를 도입함으로써 극복할 수 있습니다. Klenow Fragment(3'→5' exo-)는 마이크로어레이의 일부 형광 라벨링 반응과 차세대 염기서열 분석을 위한 DNA 라이브러리 준비에 자주 사용되는 DNA 어댑터를 DNA 단편에 결합하는 과정의 중요한 단계인 dA 및 dT 테일링에 사용됩니다.

T7 DNA Polymerase 자체는 진행도(processivity)가 낮습니다. 15 nt 미만의 결합 후 프라이머–템플릿으로부터 해리됩니다. E. coli에 감염되면 T7 파지는 숙주 단백질인 티오레독신에 부착되어 진행도(processivity) 인자로 작용합니다. T7 DNA polymerase 및 티오레독신이 일대일 복합체로 결합하고 T7 DNA 중합효소에 티오레독신이 결합하면 특히 프라이머–템플릿에 대한 중합효소의 친화력이 80배 증가합니다. 프라이머–템플릿 친화력 증가 결과 T7 DNA polymerase가 해리되지 않고 단일 가닥 DNA의 프라이머를 수천 개의 뉴클레오티드로 연장하여 DNA를 연속적으로 길게 합성할 수 있게 합니다. T7 DNA polymerase는 잔여 유전체 DNA를 제거하여 공유 결합한 원형 DNA를 정제하고 상보적 cDNA 가닥을 합성할 수 있습니다.

Poly(A) 중합효소, 또는 폴리뉴클레오티드아데닐릴전달효소는 단일 가닥 RNA를 프라이머로 사용하여 아데닌 잔기를 RNA의 3’ 종단점에 결합하고 Poly(A) 중합효소 꼬리를 RNA에 효과적으로 추가하는 촉매로 작용합니다. Poly(A) 중합효소는 템플릿 독립적인 중합효소로 말단데옥시뉴클레오티드전달효소(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)를 포함하는 패밀리 X 내 뉴클레오티드전달효소의 큰 상과에 속합니다.

폴리아데닐화는 mRNA 성숙에 필수적인 단계로, mRNA의 3’ 말단에 있는 폴리(A) 꼬리는 핵에서 mRNA 이동을 촉진하고 번역 효율을 높이며 세포질 내 mRNA 수명을 증가시킵니다. 진핵생물에서 폴리아데닐화를 담당하는 기관은 mRNA 절단 기관과 물리적으로 결합되어 있습니다. 폴리아데닐화된 mRNA의 3’ 말단 생성은 pre-mRNA가 폴리(A) 중합효소에 의해 폴리아데닐화되기 전에 엔도뉴클레오리틱 절단이 필요합니다.

분자 생물학에서 폴리(A) 중합효소에 폴리(A) 꼬리를 추가하면 진핵 세포로 전달되는 RNA의 번역이 향상됩니다. 다른 응용 기술로는 클로닝 또는 친화성 정제를 위한 RNA의 폴리(A) 테일링과 ATP 또는 뉴클레오시드 유사체 코디세핀(3’-데옥시아데노신)을 사용한 RNA의 3’ 라벨링이 있습니다.

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