기술 발전에 따라 디지털 PCR(dPCR)에 대한 접근성이 높아지고 저렴해지고 있기 때문에 디지털 PCR(dPCR)에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 따라서 dPCR은 임상 용도뿐 아니라 생명과학 연구에도 상당한 영향을 줄 가능성을 가지고 있습니다. 2019년 10월에 당사는 게스트 웨비나를 주최했으며, 이 유망한 기술을 활용하기 위한 가이드라인이 논의되었습니다.
웨비나 참석자로부터 받은 많은 흥미로운 질문을 모았습니다. 게스트 웨비나에서 상위 20개 질문 모음과 그에 대한 통찰력 있는 답변들을 읽어보세요.
이 웨비나 그리고 웨비나 후 토론 녹음을 청취하시려면 아래 링크를 클릭하세요.
“보다 정확한 디지털 PCR을 위한 팁과 요령” 발표자: Mikael Kubista 박사(TATAA Biocenter AB 및 CAS 생명공학과)
녹화된 웨비나 세션 – 여기에서 시청
이 전문가 웨비나에서, Kubista 박사는 TATAA Biocenter에서 거의 12년간 디지털 PCR을 이용한 애플리케이션 개발과 서비스 제공에 대한 자신의 경험을 공유했습니다. Kubista 박사 및 그 팀은 dPCR 분석 워크플로우에서 흔히 생기는 모든 문제를 극복하고 오류 위험을 최소화하고 견고성 및 반복성을 최대화하기 위한 확실한 표준 운영 절차를 개발하였습니다. 이 팀에서는 분석 방법 성능을 시험하고 검증하기 위한 각종 대조물질을 개발했습니다. Kubista 박사는 또한 복제 수 측정 및 희귀 돌연변이 검출에 대한 전략에 초점을 둔 dPCR 분석법 설계 및 검증에 대한 팁과 요령을 공유했습니다.
웨비나 후 질문 및 대답:
분획(partition)당 1.6 copies 및 80% 포화율 계산은 10k 분획을 기준으로 한 것이었습니다. 분획(partition) 수가 증가하면 이 계산이 어떻게 변합니까?
변하지 않습니다. 80% 포화율에 상응하는 분획(partition)당 1.6 copies는 분획 수와 관계 없이 정밀도에 있어 최적의 조건입니다. 하지만 일반적으로 분획(partition) 수가 증가함에 따라 부정확성(오류)은 감소합니다.
분획(partition) 수가 증가하면, LOD=3 대신 단일 분자를 검출할 수 있습니까?
분석항목이 양호하다고 가정할 때, PCR은 단일 분자를 증폭하여 검출합니다. LOD는 분자가 존재하는 경우의 검출에 관한 것이 아니라, 총 검체(예: 환자의 혈액)의 극히 일부만 분석하기 때문에 분자가 칩에 로딩되는 확률에 관한 것입니다. 95% 확률로 양성이기 위해서는 검체에 분석하는 총 부피 당 최소한 3개의 표적 분자가 포함되어 있어야 합니다. 따라서, 분석된 부피당 검체에 3개의 표적이 포함되어 있고 실험을 100번 반복한다면, 95회의 실험은 양성이고 5회는 음성일 것으로 예상합니다. LOD는 측정 기법에 무관하며, 검체 채취 모호성의 결과입니다.
두 표적 시퀀스 모두를 포함하는 합성 절편을 사용하여 ValidPrime과 비교하여 새 분석항목을 검증할 때, 두 분석법으로 측정한 농도가 다른 경우가 얼마나 흔히 있습니까?
모두 같은 분자의 일부이므로 농도는 동일하지만, 측정량이 다른지 여부를 질문하시는 것으로 생각됩니다. 각 분석항목은 다른 실험 조건을 필요로 할 수 있으므로 각 분석항목을 개별적으로 최적화하는 싱글플렉스로 분석법을 실행하는 것이 중요합니다. 최적화하고 나면, 우리가 자체 설계한 대부분의 분석항목은 검증을 통과합니다(즉, ValidPrime과 동일한 수치).
미세방물(droplet) 기반 dPCR 사용 시 절대 정량화 정확도가 향상됩니까?
표준 곡선을 기준으로 시험 검체의 농도를 추정하는 경우, 불확실성은 여러 요인에 좌우됩니다. 측정 불확실성이 그 중 하나입니다. 선형 반응 때문에 qPCR보다 dPCR의 재현성이 높으므로, 이론상 이 경우도 이에 해당할 것으로 예상합니다. 실제로 대부분의 워크플로우들은 분석 단계보다 더 혼동을 주는 업스트림 사전 분석 단계가 있으며, 이 경우에는 차이가 없을 것입니다.
설명한 dPCR에 대한 멀티플렉싱 옵션이 더 많다는 점을 감안할 때, 모든 dPCR 플랫폼에 대해 1/2의 프로브 희석을 사용할 수 있나요?
그렇습니다. 하지만 클론 증폭이 필요하다는 점을 알아두셔야 하는데, 이는 분획(partition) 수가 더 많은 플랫폼에서 달성하기가 더 쉽습니다.
단일 염료 분석법을 사용하여 듀플렉싱(duplexing)할 때 프라이머 효율이 표적 시퀀스의 분리에 영향을 줄 수 있나요? 최근에 듀플렉싱(duplexing) 분석항목에서 동일한 염료를 사용하여 프라이머 농도를 다르게 하지 않고서 표적(target)이 구별될 수 있음을 경험했습니다. 이점이 프라이머 효율 문제일 수 있나요?
질문자께서 분석항목 효율을 뜻하는 것이라고 가정할 때, 이 전략을 사용하여 표적이 구별될 수 있는 것이 맞습니다. 프라이머가 다른 Tm 또는 앰플리콘을 가지는 경우, 길이가 다르면 다른 연장 시간이 필요하며, 상당히 다른 효율로 표적을 증폭하는 사이클링 조건이 설정될 수 있습니다. 그런 다음 Cq 수치로 표적(target)을 용이하게 구별할 수 있습니다. 하지만 이 경우 실시간 검출이 필요합니다. 이는 기존 종말점 dPCR에 의해서도 구별될 수 있기는 하지만 견고성이 훨씬 떨어집니다.
dPCR을 사용하여 어떻게 DNA 농도를 정량하나요?
마우스, 인간, 랫트의 경우 ValidPrime 분석항목을 이용할 수 있습니다. 다른 생물체의 경우, 사용자가 분석항목을 설계하고 검증해야 합니다. 이를 위해서는 DNA 내 관심 대상의 단일 복제 유전자 위치를 표적으로 하여 dPCR을 실행하는 다중 분석항목을 설계합니다. 다중 분석항목이 동일한 수치를 내면, 해당 분석항목이 단일 복제 유전자 위치를 표적으로 하고 정량적인 것으로 가정하는 것이 합당합니다. 상세한 정보는 다음에서 찾아볼 수 있습니다. http://www.tataa.com/services/.
정확도와 관련하여 dPCR의 유효성 검증에 대한 권장 절차가 있을까요?
정확성을 위해서는 표준이나 기준 방법과 비교해야 합니다. 인간 유전체 DNA의 경우, SRM 2372a 또는 SRM 2372a에 대해 캘리브레이션한 2차 표준과 비교하십시오.
ValidPrime 표적 시퀀스의 길이는 어떻게 되나요?
인간 ValidPrime 표적 시퀀스는 143 bp이고 분석항목은 광범위하게 특성화되었습니다.
표준품 화학적 합성의 불완전한 부산물이 없음을 어떻게 증명하나요?
증명하지 않습니다. ValidPrime 분석법을 사용하여 (합리적으로) 온전한 표준품의 농도를 측정합니다.
시약을 정제할 필요가 있나요?
시험에 따라 다릅니다. 복제 수 변이(For copy number variation, CNV) 측정의 경우, 시약 내 인간 gDNA 오염은 무시할 수 있을 것으로 예상되지만, 세포 내 미토콘드리아 정량화의 경우 이는 중요할 수 있으며 고대 DNA의 경우에는 매우 중요할 수 있습니다.
EvaGreen 기반 표적 검출은 일반적으로 프로브 기반 분석에 비해 "더 지저분(messier)"합니다. EvaGreen 분석법은 어떻게 개선될 수 있나요?
EvaGreen은 존재하는 모든 dsDNA에 비특정적으로 결합하기 때문에, 배경(background)은 미세방울 내 절편 길이에 좌우됩니다. 일반적으로 제한 절단(표적 시퀀스를 절단하지 않도록 하기 위해) 또는 초음파 처리를 이용하여 절편 길이를 균일하게 하여 배경 비(background rain)를 줄일 수 있습니다. 또한 로딩하는 총 DNA 양을 줄여서 비(rain)를 줄이려고 시도할 수도 있습니다.
모든 dPCR 기기의 성능이 다 비슷한가요 아니면 그 중 일부는 더 우월한가요?
dPCR 기기의 성능은 분획(partiton) 수, 채널 수, 실시간 검출, 다중 판독, 개방/폐쇄 시스템 등과 같은 서로 다른 특징을 가지고 있기 때문에 다릅니다. 기기 비용이 이를 반영합니다. 사용자에게 최적인 기기는 사용자의 필요성에 따라 다릅니다. TATAA dPCR 코스 가입을 고려해 보세요. 결정을 내리는 데 도움이 되도록 모든 주요 플랫폼을 테스트할 수 있습니다.
저는 분자 진단 환경 병원체 검출에 ddPCR을 사용합니다. 어느 정도까지 ddPCR을 사용하여 qPCR 분석항목을 캘리브레이션할 수 있나요?
분석항목 조건이 동일하다면(동일한 프로토콜 및 시약) 캘리브레이션은 신뢰성이 있습니다. 하지만 현장 검체 내 억제가 흔히 발생하므로 이에 대해 검사해야 합니다. 이는 스파이크를 통해 수행합니다.
qPCR과 dPCR의 민감도 비교에 관한 것입니다. 기기에 주입해야 하는 검체량이 정량화 한계를 결정하는 것이지요? dPCR 기기 및 qPCR에 대한 일반적인 검체 주입량은 얼마인가요?
검체 노이즈(푸아송 분포)가 우세한 조건하에서는 분석된 총 부피가 정량화에 대한 한계가 됩니다. qPCR의 경우, 분석량에 있어 방대한 차이가 있습니다. BioMark IFC(Fluidigm) 반응액 부피는 약 10nl 정도뿐이며, 농도 증가를 위해 검체가 사전 증폭되지 않는 한 정확성은 없습니다. 한편, aAmp(AlphaHelix)는 최고 대류를 사용하여 100µl를 분석합니다. dPCR에서, 사용자는 보통 더 많은 서브어레이(subarrays) 또는 다중 칩을 실행하여 총 부피를 조절할 수 있습니다. 예를 들어, QX200 미세 방울 크기는 0.85nl이며, 이는 20,000개의 미세 방울을 가정할 때 총 분석량이 17µl가 됩니다.
SNP를 이용한 품질 관리 애플리케이션에 dPCR이 적절할까요(예: 0.1% 척도에서 희귀 대립 유전자의 농도를 정밀하게 추정할 수 있음)?
네, 그렇습니다. 이는 가장 인기있는 애플리케이션 중 하나입니다. 이 분석항목은 여러 wild-type 분자를 함유하고 있는 분획물에서 위양성을 방지하기 위해 여전히 특이성이 있어야 합니다.
dPCR에 대한 프로브 설계에 어떤 소프트웨어를 사용하나요?
dPCR에 대한 분석항목 설계는 qPCR과 다르지 않습니다. 표준 분석항목 설계 파이프라인을 사용하십시오.
Eva/SYBR ddPCR에 대한 최대 DNA 크기는 얼마인가요?
더 높은 형광도를 내기 때문에 앰플리콘 길이가 길수록 좋습니다. 템플릿을 복제할 정도로 연장 시간이 충분하고 2차 구조에 문제가 없다면 상한은 없습니다. 100–250bp가 합당한 목표 범위입니다.
단일 반응에서 다른 농도의 프라이머를 사용하는 멀티플렉싱에 대해 좀 더 설명해 주시겠어요? 기기 단독을 사용해서 쉽게 구별이 가능한가요, 아니면 이 결과를 분석하기 위한 추가 도구가 필요한가요?
잘 설계되고 검증된 분석항목, 클론 증폭, 복잡하지 않은 검체의 경우에는 표준 기기 소프트웨어에서 구별 가능합니다. 하지만 최적화하기에 복잡한 시스템이기 때문에 우리는 멀티플렉싱에 프로브 사용을 선호합니다.
ValidPrime 분석항목이나 기준 분석항목을 박테리아 프로세스에 사용할 수 있나요? 박테리아 표적(target)을 검증할 수 있나요?
검증은 합성 템플릿에서 수행되기 때문에 어떠한 표적에 대해서든지 표준 ValidPrime 분석항목을 사용하여 새로 설계한 분석항목을 검증할 수 있습니다. 하지만, 내인성 표준품으로 사용하기 위해서는 ValidPrime 분석항목이 반드시 균주를 표적으로 해야 합니다. TATAA에서는 제한된 수의 검증된 종별 ValidPrime 분석항목만 제공하지만, 문헌에서 학계 그룹에서 개발한 정보를 찾아보실 수 있습니다. 그것들은 광범위하게 검증되지는 않았을 수 있지만 사용자의 목적에는 충분할 수 있습니다.