随着技术的进步，数字PCR (dPCR)越来越容易获得和负担得起，人们对它的兴趣也越来越大。因此，dPCR有潜力对生命科学研究和临床应用产生重大影响。2019 年 10 月，我们举办了一次嘉宾网络研讨会，就如何利用这项前景光明的技术进行了讨论。
我们从网络研讨会参与者们那里收到了很多有趣的问题。阅读我们汇编的前20个问题，以及我们的演讲者嘉宾富有洞察力的回答。
请点击下面的链接收听本次网络会议的录音，以及网络会议后的讨论。
“”来自TATAA生物中心AB和中国科学院生物技术系的Mikael Kubista博士，为我们介绍更精确的数字PCR的经验和技巧
网络研讨会录像 – 点击此处观看
在这次专家网络研讨会上，Kubista博士分享了他在TATAA生物中心近12年来使用数字PCR开发应用程序和提供服务的经验。他和他的团队克服了所有 dPCR 分析工作流程中的常见问题，开发出了稳健的标准操作程序，将出错风险降至最低，并最大程度地提高了稳健性和重复性。他们开发出了不同的对照，以便对各种方法进行测试和验证。他还分享了有关 dPCR 检测方案设计及验证的建议和技巧，重点讲述了拷贝数定量及罕见突变检测的相关策略。
研讨会后问答：
1.6 个拷贝/反应分区及 80 % 饱和度的计算依据的是一万个反应分区。如果反应分区的数目增多，这将会有什么变化？
不会有变化。对于精确性而言，与 80% 的饱和度相对应的每个反应分区 1.6 个拷贝是最佳状态，这是独立于反应分区数目的。然而，随着分区数量的增加，精确性误差(错误)通常会减少。
如果增大反应分区数目，能够检出单个分子而不是 LOD=3 吗？
假设检测是良好的，PCR 可扩增一个单分子，因此可检出单个分子。由于我们仅对总样本的一小部分进行分析，LOD 的意义并不在于检测一个分子以判断其是否存在，而是用于衡量一个分子被加载到芯片上的可能性。样本的每个总体积中应含有至少 3 个靶分子才能使该分析以 95% 的概率被鉴定为阳性。因此，如果一个样本每个体积中含有 3 个靶分子，而该实验重复进行了 100 次，我们预期 95 次的实验是阳性的，但有 5 次是阴性的。LOD 是独立于测定技术的；它是由采样模糊性造成的。
当使用包含两种目标序列的合成片段对ValidPrime进行新的检测方案验证对比时，你看到这两种检测给出不同浓度的测定结果的频率有多高？
浓度是相同的，因为它们同属于同一个分子，但我想你是在问测定的量是否不同。将检测assay作为单重检测运行，对每个检测方案进行单独优化非常重要，因为这些检测assay可能需要不同的运行条件。经过优化后，我们在内部设计的大多数检测方案都能通过验证（即与 ValidPrime 的计数相同）。
基于微滴式的 dPCR 的绝对定量准确性是否更好？
在根据某个标准曲线来估算测试样本的浓度时，不确定性取决于若干因素；测量不确定性是其中之一。鉴于 dPCR 的可重复性比 qPCR 更高——因反应是线性的，我预计理论上讲应该是这样的。在实践中，大多数工作流程具有上游的分析前步骤，这些步骤比分析步骤更加复杂，在这种情况下，将没有区别。
基于dPCR具有更高的多重性，是否可以对所有的dPCR平台使用半探针稀释?
是的，但要注意，你需要获得克隆性扩增，这在反应分区数目更大的平台更容易做到。
在使用单一染料检测进行双重分析时，引物效率会影响靶序列的区分吗？我最近注意到，在双重检测中使用同一个染料时，各靶标即便在不改变引物浓度的情况下仍能够被区分。这可能是个引物效率问题吗？
假定你指的是检测效率，你说得不错，靶标能够使用该策略进行区分。如果引物有不同的 Tm 或扩增子，不同的长度需要不同的延伸时间，设置的循环条件可使各靶标以不同的效率进行扩增。然后，靶标可通过 Cq 值被轻易区分开。但是，这需要采用实时检测。靶标也可通过常规终点 dPCR 区分，但该方法的稳健性要差得多。
如何使用 dPCR 进行 DNA 浓度定量？
对于小鼠、人体及大鼠，可选用 ValidPrime 检测方案。对于其他生物体，你必须自行设计和验证检测方法。方法是，以你感兴趣的 DNA 中的单拷贝基因位点为靶标设计多个检测，并运行 dPCR。如果多个检测给出相同的计数，则有理由认为这些检测的确可靶向单拷贝基因位点，且可定量。更多信息，请见此处：http://www.tataa.com/services/.
就准确性而言，你能推荐一些 dPCR 验证流程吗？
为了验证准确性，需要与一个标准或参照方法进行比较。对于人类基因组 DNA，可与 SRM 2372a 或一种采用 SRM 2372a 进行过校准的二级标准物进行比较。
ValidPrime 靶序列有多长?
人类 ValidPrime 靶序列的长度为 143 bp，且该检测获得了广泛的表征。
你如何证明该标准的化学合成中没有不完整的副产物?
无法证明。你使用 ValidPrime 检测测定的是（大致）完整标准物的含量。
我们需要清洁试剂吗？
这取决于具体的研究。对于拷贝数变异（copy number variation，CNV）测定，试剂中的人体 gDNA 污染是可忽略的；对于细胞中的线粒体定量，这一点可能是重要的；而对于古代 DNA，这可能是至关紧要的。
基于 EvaGreen 的靶标检测通常比基于探针的检测更“脏乱”。如何才能改进 EvaGreen 检测？
EvaGreen 可与存在的所有 dsDNA 结合，因此，背景取决于微滴里的片段长度。通常可以通过对片段长度进行均质化来降低背景雨滴，最好使用限制性酶切法（以防止剪切靶序列）或超声处理。你还可以通过减少 DNA 的加载总量来减低雨滴现象。
各 dPCR 仪器的性能是相当的吗？或者是否有些仪器比另一些仪器更好？
dPCR 仪器的性能是不同的，因为它们有不同的特性，例如反应分区数目、通道、实时检测、多重读取、开放/闭合系统等。仪器的价格可反映这些特性。哪一款仪器最适合您，将取决于您的具体需求。可以考虑参加 TATAA dPCR 课程，它将允许您测试所有领先的平台，从而指导您做出正确的决策。
我在分子诊断环境的病原体检测方面使用 ddPCR。在何种程度上我可以使用 ddPCR 来校准 qPCR 检测？
当检测条件保持不变（相同的方案和试剂）时，校准才是可靠的。但是抑制作用在现场样本中是常见的，且应得到测试。方法是使用某个掺入物。
关于 qPCR 与 dPCR 的灵敏性比较，放入仪器的样品体积决定了定量的限度，对吧? dPCR 和 qPCR 的常规样本输入体积是多少？
在采样噪音（泊松分布）占优势的条件下，分析的总体积将成为定量的限制性因素。对于 qPCR，分析的体积有巨大的差异。BioMark IFC (Fluidigm) 的反应体系体积只有 10 nL，除非样本经过预扩增以增大浓度，否则就没有准确性。同时，aAmp (AlphaHelix) 使用超对流分析 100 µL 的样本。在 dPCR 中，你通常可以通过运行更多子阵列或多个芯片来控制总体积。例如，QX200 微滴大小为 0.85 nL，假定总微滴数为 20,000 个，那么总分析体积将是 17 µL。
dPCR 对于适用于SNP 的质量控制应用吗？（例如，能够以 0.1% 的尺度准确估算某个罕见等位基因的浓度吗？）
是的，的确如此。这是最流行的应用之一。该检测还必须具有特异性，以防止偶然含有多个野生型分子的反应分区中出现假阳性。
在为 dPCR 设计探针时，可使用什么软件？
dPCR 的检测设计与 qPCR 没有什么不同。使用您的常规检测设计工具就可以了。
对 Eva/SYBR ddPCR 而言，DNA 片段长度最长可以是多少?
应优选较长的扩增子，因为这样的扩增子给出的荧光信号较多。如果延伸时间足以完成模板复制，则长度没有上限，且对于二级结构也没有问题。100–-250 bp 是一个合理的目标范围。
对于在单个反应体系中采用不同引物浓度进行多重分析，您能更详细地解释一下吗？仅使用仪器就可以进行区分吗，还是需要使用其他工具来分析这些结果？
对于设计良好并经过验证的分析、克隆扩增和非复杂样本，在常规的仪器软件中应该就能进行区分。然而，对优化工作而言这是一个复杂的系统，我们更喜欢使用探针进行多重分析。
可以使用 ValidPrime 检测或参比检测进行细菌相关处理吗？能够验证细菌靶标吗？
由于是对合成的模板进行验证，你可以使用常规 ValidPrime 检测，就任何靶标来验证新设计的检测方法。然而，要作为内源性参考，ValidPrime分析必须以菌株为目标。TATAA只提供有限数量的经过验证的物种特异性ValidPrime分析，但你可以在学术团队发表的文献中找到更多。这些检测可能未经过此等程度的广泛验证，但对于你的用途而言可能已经足够好。