RNA 提取小技巧

技巧 1：仔细考虑起始样本的量。

对于大多数土壤，每份样本的最大量为 2 克。但对于沉积物而言，含水量的增高意味着 2 克样本中的土壤颗粒物含量变少了。这可能会导致从这些原本微生物丰度就较低的样本中获得的 RNA 产量降低。因此，对于沉积物样本，建议采用最多 5 克的样本湿重。

提示：如果您注意到采样后的土壤上层有大量的水，您可以在将样本加入到含研磨珠裂解管后对其进行短暂离心以去除多余的水分。

技巧 2：使用对土壤适用的 PCI

使用正确的苯酚: 氯仿：异戊醇（Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol，PCI）比率很重要——请参见试剂盒手册中的相关建议。苯酚在 PCI 中应采用 25:24:1 的比例，其 pH 应在 6.7 和 8 之间，存放时上方封以 pH 8.0 的 TE 缓冲液。对于动物组织和细胞样本，在 RNA 制备中采用低 pH 苯酚是适宜的，但对于土壤样本，需要采用中性 pH 苯酚才能获得最佳结果。

技巧 3：优化异丙醇沉淀。

在 PCI 提取及添加至 Solution SR3（SR3 溶液）中后，下一步是异丙醇沉淀以提取总核酸。如果您从沉积物开始操作，您可能会在添加 SR3 后获得超过 5 ml 的样本。您将需要在方案的第 11 步中将 SR4（异丙醇）的用量增大到与样本相同，以确保沉淀完全。

技巧4：对于高盐度样本，需要调整异丙醇沉淀的温度。

标准的试剂盒方案是将样本放在 -20℃ 下冷冻。但对于含盐度高的样本，由于零度以下的温度可能会导致盐分的沉淀，从而导致纯化过程中与阴离子交换柱的结合条件发生改变，最好在室温下完成沉淀步骤。您可以通过观察沉淀物的外观来判断样本中是否有盐分沉淀：如果沉淀物较大且呈硬壳状，而非像正常 RNA 沉淀物那样呈平坦和光滑状，则存在盐分沉淀。由于水分过多，即便是来自淡水湖的沉积物样品也往往含有盐分。

停止点：对于某些土壤样品，可能能够在第 12 步将孵育时间延长至超过 30 分钟或甚至过夜，而不会对结果造成不利影响。但首先，请确保对您的土壤样本进行此等测试。

技巧 5：确保适宜的柱内液流。

最终的 RNA 纯化柱中装有树脂，液体可在重力作用下以滴流方式通过柱体。有时，由于树脂被向下压实，液流的流动会变缓慢。施加轻柔的正压可有助于增快缓冲液和样本流经阴离子交换柱的流速。

提示：如果持续存在流率困难，您可以尝试使用 5 ml 注射器的针筒向柱体中施加轻微的压力以增大流速。要这样做，请将注射器针筒的末端紧紧地对靠到离心柱的开口上。将针筒紧靠到离心柱上以阻止空气从柱体上方逃逸，同时推动注射器的柱塞。施加非常轻柔的压力，使流率不超过每秒 1 滴。

技巧 6：充分混匀不同组分。

有时，含有异丙醇的溶液可在货架存放期间发生（成分）分离。为了确保成分的均质性，请在使用前摇荡 SR5 和 SR6 溶液。通常摇荡 10 秒就已足够。

技巧 7：节省洗脱流程的用时。

如果您在之前使用过该试剂盒且在实验室中有信心，您可以考虑通过直接洗脱到 2 ml 采样管中，而不是 15 ml 试管中来节省时间。这将可节省一步转移步骤并可避免浪费塑料用品。如果您采用该方法，则重力柱必须牢靠地平衡在管架中的采样管中。

技巧 8：确保最后的异丙醇沉淀采用适宜的温度。

从重力流柱中洗脱后，最后的沉淀步骤将 在-20℃ 条件下使用异丙醇完成（Solution SR4）。在 -20℃ 而不是在室温条件完成该步骤至关重要。

停止点：如果可用时间不足以完成制备操作，流程可在此处停止数小时或过夜。当样本被冷冻在 -20℃ 下时，RNA 是稳定的。

技巧 9：追踪观察 RNA 沉淀物。

经异丙醇沉淀并离心步获得的 RNA 沉淀物，正常情况应该较小且光滑。确保将试管以相同的方式/朝向放置在离心机中，以便您在倾倒异丙醇时能够快速识别所有试管中沉淀物的位置。

提示：要加速沉淀物的干燥过程，您可将一张无绒纸巾放在一个已打开（运行中）的组织培养罩进气口上，并将试管（倒置着）放到该纸巾上。

技巧 10： 使用合适体积的水来溶解RNA 。

一旦获得了干燥的沉淀物，根据您进行逆转录时的需要，以适当的体积对 RNA 进行溶解。例如，如果相关土壤的微生物产量较高，您可以加 50-100 μl 水来溶解RNA。（通常而言，最终的浓度为 ~100-200 ng/ul。）对于微生物生物含量较低的沉积物和干性土壤样品，首选采用 25 μl，来获得较高的 RNA 的使用浓度。在本步骤，您可以灵活决定用于沉淀物再溶解的最佳水量。