克隆和 DNA 重组

黏端或平端：修饰、退火和连接

克隆和 DNA 重组技术为研究基因和细胞在健康及疾病中的作用提供了许多见解。现在，随着创新性应用的出现，例如组合文库的高通量集合和表观遗传学修饰的定位，克隆技术及其应用已经有了进一步发展。

克隆用酶

将模板 DNA 克隆到合适的质粒载体之前，可能需要进行末端修饰。确定用于克隆的 DNA 通常通过限制性酶切或 PCR 扩增从其来源中分离。Klenow Fragment、T4 DNA 聚合酶和 T4 多核苷酸激酶等专用酶产品可以修饰 3’ 或 5’ 末端，从而改善 DNA 片段和载体之间的共价连接。

接下来的克隆步骤是使用适合于使载体和插入片段末端退火的酶进行连接。

加尾通常是为了制备 T 载体用于 TA 克隆，或在高保真聚合酶（非 Taq）产生的 PCR 产物上加 A 尾用于 TA 克隆。使用 Taq DNA 聚合酶扩增的产物已经带有 A 尾。

DNA 末端修饰用酶

酶	末端修饰
	末端补平 5’→3’	末端补平 3’→5’	加 A 尾用于克隆	末端 5’ 磷酸化
P7060L Klenow Fragment 即将推出	✔ 是	✔ 是	✘ 否	✘ 否
P7080L T4 DNA Polymerase*	✔ 是	✔ 是	✘ 否	✘ 否
P7010 Klenow (3’→5’ exo-)	✘ 否	✘ 否	✔ 是	✘ 否
Y9040L T4 Polynucleotide Kinase	✘ 否	✘ 否	✘ 否	✔ 是
Y9140† End Repair Mix	✔ 是	✔ 是	✘ 否	✔ 是

DNA 连接用酶

酶	连接
	黏端连接	平端连接	切口密封
*L6090L E. coli* DNA Ligase** 即将推出	✔ 是	✘ 否	✔ 是
L6010L T3 DNA Ligase 即将推出	✔ 是 A/T > G/C [1.0 M NaCl]	✔ 是	✔ 是
L6030 T4 DNA Ligase 即将推出	✔ 是	✔ 是	✔ 是
EN11 T4 DNA Ligase BLIRT	✔ 是	✔ 是	✔ 是
L6020L T7 DNA Ligase 即将推出	✔ 是	✘ 否	✔ 是
EN13 Tth DNA Ligase*	✔ 是	✘ 否	✔ 是
L6060L Taq DNA Ligase^†即将推出	✘ 否	✘ 否	✔ 是

这是一种 SLIC 克隆方式

不依赖序列和连接的克隆 (sequence and ligation independent cloning, SLIC) 利用了核酸外切酶活性：

用于新一代测序的克隆

用于新一代测序的文库从片段化 DNA 开始。通过酶的作用完成克隆步骤。

icon-genomics平端片段
使用 T4 DNA 聚合酶、Klenow Fragment 和 T4 PNK 酶造成平端和 5’ 磷酸化。
icon-bio-informatics末端加 A 尾
接下来，使用下列任一种酶对 3’ 端加 A 尾：Taq DNA 聚合酶或 Klenow Fragment (3’→5’ exo-)。
icon-barcode添加接头
然后，通过与最终酶 T4 DNA 连接酶连接来添加互补的接头或标记。

DNA 文库构建所需的所有酶组分都可以用接头组装成“自制”文库制备试剂盒。

基因合成

基因合成是基于连接具有长互补重叠区域的寡核苷酸。

icon-temperature热稳定 Taq DNA 连接酶
通过使用热稳定 Taq DNA 连接酶而非 T4 DNA 连接酶来改善合成。

较高的连接温度增加了形成正确连接产物的概率。
icon-target切口选择性连接酶

使用切口选择性连接酶来避免因跨越缺口的连接而导致的缺失。

合成的长 DNA 不会无序连接。

发现用于克隆和 DNA 重组的特色酶

有关克隆和重组用酶的常见问答

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