Mikrobiom

Tipps zur RNA-Isolierung

Erfolgreiche Isolierung von hochwertiger RNA aus Bodenproben

Die RNA-Isolierung aus Bodenproben ist eine der schwierigsten Anwendungen in der molekularbiologischen Umweltforschung. Nicht nur ist die Degradation eine ständige Herausforderung, sondern auch die RNA-Ausbeute ist eher gering.

Eine mögliche Ko-Kontamination der RNA durch den Gehalt an Huminsäuren und Inhibitoren im Bodenmaterial stellt ebenfalls eine Herausforderung dar. Reinheit ist für RNA-Anwendungen unerlässlich. Bei der Zugabe zur Reaktion sollte die RNA konzentriert sein und es dürfen keine Inhibitoren vorliegen.

Geringe RNA-Ausbeuten, die in der Regel zwischen 10 % und 20 % der DNA-Ausbeute liegen, bedeuten, dass zur Isolierung einer Probe für Forschungszwecke eine größere Probenmenge, größere Röhrchen (15 ml) und eine Zentrifuge mit größerer Kapazität verwendet werden müssen. Da eine Verdünnung der RNA für die reverse Transkription bei der Suche nach Genen mit geringer Kopienzahl am besten vermieden werden sollte, ist die erfolgreiche Entfernung von Inhibitoren entscheidend.

Um diese Herausforderungen zu meistern, bietet QIAGEN^® das RNeasy^® PowerSoil^® Total RNA Kit an, das speziell für die unkomplizierte RNA-Extraktion aus Bodenproben entwickelt wurde.

Bei dem Protokoll handelt es sich um eine sorgfältig getestete Verfahrenskombination: Inhibitor Removal Technology (IRT^®) zur Entfernung von Inhibitoren, Phenol-Chloroform-Extraktion zur vollständigen Lyse von Mikroorganismen und Anionenaustausch für eine hochwertige Aufreinigung. Das Endergebnis ist die Isolierung von sauberer RNA in der gewünschten Menge, die eine maximale Verwendung in der RT-PCR ermöglicht.

Vom lehmigen Waldboden bis zum Flusssediment hat jeder Boden eine andere Textur, Feuchtigkeit und mikrobielle Belastung. Mit dem RNeasy PowerSoil Total RNA Kit können Sie Ihr Extraktionsverfahren an den jeweiligen Fall anpassen.

Zehn Tipps zur RNA-Isolierung

Hier finden Sie zehn Tipps zur Vermeidung von Problemen und zur Optimierung der Ergebnisse, wenn Sie sich an die Protokollschritte des RNeasy PowerSoil Total RNA Kit halten.

Tipp 1: Wählen Sie die Menge der Ausgangsprobe sorgfältig aus.

Für die meisten Bodenproben gilt eine Höchstmenge von 2 Gramm je Probe. Bei Sedimenten bedeutet der höhere Wassergehalt jedoch, dass eine 2-Gramm-Probe weniger Bodenpartikel enthält. Bei Proben, die bereits eine geringe mikrobielle Belastung aufweisen, kann dies zu einer geringeren RNA-Ausbeute führen. Daher werden für Sedimente Proben mit einem Nassgewicht von bis zu 5 Gramm empfohlen.

Hinweis: Sollte sich nach der Entnahme eine größere Menge Wasser auf dem Bodenmaterial befinden, können Sie die Probe kurz nach dem Einfüllen in das Beads-Röhrchen zentrifugieren, um das überschüssige Wasser zu entfernen.

Tipp 2: Verwenden Sie eine für die Bodenprobe geeignete PCI-Extraktion.

Die Verwendung des richtigen Verhältnisses des Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Gemisches (PCI) ist wichtig – siehe Empfehlungen im Kit-Handbuch. Das Phenol bei der PCI-Extraktion sollte in einem Verhältnis von 25:24:1 vorliegen und der pH-Wert sollte zwischen 6,7 und 8 liegen, gelagert unter TE-Puffer pH 8,0. Im Gegensatz zu tierischen Gewebe- und Zellproben, für die in der RNA-Vorbereitung ein Phenol mit niedrigem pH-Wert geeignet ist, benötigen Bodenproben ein Phenol mit neutralem pH-Wert, um beste Ergebnisse zu erzielen.

Tipp 3: Optimieren Sie die Isopropanol-Ausfällung.

Nach der PCI-Extraktion und Zugabe zur Lösung SR3 erfolgt als nächster Schritt die Ausfällung mit Isopropanol, um alle Nukleinsäuren zu isolieren. Sollten Sie mit Sedimenten begonnen haben, könnten Sie nach Zugabe von SR3 mehr als 5 ml Probenmaterial haben. Um eine vollständige Ausfällung zu gewährleisten, müssen Sie die Menge an SR4 (Isopropanol) erhöhen, bis sie dem Volumen der Probe in Protokollschritt 11 entspricht.

Tipp 4: Passen Sie bei Proben mit hohem Salzgehalt die Temperatur der Ausfällung von Isopropanol an.

Das Standardprotokoll des Kits sieht vor, die Proben bei –20 °C einzufrieren. Bei Proben mit hohem Salzgehalt ist es jedoch besser, die Ausfällung bei Raumtemperatur durchzuführen, da Temperaturen unter 0 °C die Ausfällung des Salzes bewirken, wodurch sich die Bindungsbedingungen für die Anionenaustauschersäule bei der Aufreinigung ändern. Ob die Probe Salz ausgefällt hat, erkennen Sie am Aussehen des Pellets: Wenn es groß und verkrustet ist, und nicht flach und glänzend wie ein normales RNA-Pellet, könnte Salz vorliegen. Aufgrund des Wasserüberschusses sind Sedimentproben selbst aus Süßwasserseen meist salzig.

Haltepunkt: Bei einigen Böden kann die Inkubation in Schritt 12 ohne Beeinträchtigung der Ergebnisse länger als 30 Minuten oder sogar über Nacht dauern. Testen Sie dies jedoch zunächst an Ihren eigenen Bodenproben.

Tipp 5: Achten Sie auf einen ordnungsgemäßen Durchfluss durch die Säule.

Die für die finale Aufreinigung der RNA verwendeten Säulen bestehen aus einem gepackten Harz, das die Schwerkraft nutzt, um durch die Säule zu tropfen. Manchmal geschieht dies nur langsam, weil das Harz verdichtet ist. Der Durchfluss der Puffer und der Probe durch die Anionenaustauschersäule kann durch leichten Überdruck gesteigert werden.

Hinweis: Bei anhaltenden Schwierigkeiten mit der Durchflussrate können Sie versuchen, mit dem Zylinder einer 5-ml-Spritze leichten Druck auf die Säule auszuüben, um den Durchfluss zu verbessern. Halten Sie dazu das Ende des Zylinders der Spritze fest an die Säulenöffnung. Drücken Sie den Kolben in die Spritze und drücken Sie den Kolben fest an die Säule, damit die Luft nicht am oberen Säulenende entweicht. Üben Sie einen sehr sanften Druck aus, der eine Durchflussrate von 1 Tropfen pro Sekunde nicht überschreitet.

Tipp 6: Mischen Sie die Komponenten ausreichend.

Manchmal können sich isopropanolhaltige Lösungen bei der Lagerung im Regal entmischen. Durch Schütteln der Lösungen SR5 und SR6 wird sichergestellt, dass diese vor ihrer Verwendung homogen sind. Meist reicht es aus, sie 10 Sekunden lang zu schütteln.

Tipp 7: Sparen Sie Zeit bei der Elution.

Wenn Sie das Kit bereits verwendet haben und sich im Labor sicher fühlen, können Sie Zeit sparen, indem Sie direkt in ein 2-ml-Entnahmeröhrchen eluieren, anstatt in das 15-ml-Röhrchen. Dies spart einen Transferschritt und vermeidet zusätzlichen Plastikmüll. Sollten Sie auf diese Weise vorgehen, muss die Schwerkraftsäule sicher auf dem Entnahmeröhrchen in einem Gestell stehen.

Tipp 8: Achten Sie für die endgültige Ausfällung mit Isopropanol auf die richtige Temperatur.

Nach der Elution durch die Schwerkraftsäule erfolgt die endgültige Ausfällung erneut mit Isopropanol (Lösung SR4) und durch Inkubation bei –20 °C. Dieser Schritt muss unbedingt bei –20 °C erfolgen und nicht bei Raumtemperatur.

Haltepunkt: Lässt sich die Vorbereitung in der zur Verfügung stehenden Zeit nicht abschließen, kann der Prozess hier für einige Stunden oder über Nacht unterbrochen werden. Wenn die Probe bei –20 °C eingefroren wird, ist die RNA stabil.

Tipp 9: Behalten Sie das RNA-Pellet im Auge.

Nach der Zentrifugation zur Gewinnung der RNA aus dem Isopropanol ist das normale Pellet klein und glasig. Achten Sie darauf, dass die Röhrchen in der Zentrifuge gleich ausgerichtet sind, damit Sie beim Dekantieren des Isopropanols schnell erkennen können, wo sich das Pellet in allen Röhrchen befindet.

Hinweis: Die Trocknung des Pellets kann beschleunigt werden, indem die Röhrchen (umgedreht) auf ein fusselfreies Wischtuch auf dem Luftstromeinlass der Gewebekulturhaube gestellt werden, während diese eingeschaltet ist.

Tipp 10: Berücksichtigen Sie die für die Resuspension der RNA verwendete Wassermenge.

Sobald Sie ein trockenes Pellet in der Hand haben, resuspendieren Sie die RNA in einem Volumen, das sich nach der Menge richtet, die Sie für die reverse Transkription benötigen. Wenn die Bodenprobe beispielsweise eine hohe Ausbeute an Mikroorganismen aufweist, kann die Resuspension in 50–100 ul Wasser erfolgen. (Meist beträgt die Endkonzentration ~100–200 ng/ul). Bei Sedimenten und trockenen Böden mit geringer mikrobieller Biomasse sind 25 ul vorzuziehen, damit die RNA für die Weiterverwendung stärker konzentriert ist. In diesem Schritt haben Sie die Möglichkeit, die beste Wassermenge für die Resuspension des Pellets zu wählen.

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