dPCR für Anfänger

Entwicklung der dPCR

Die komplexen Forschungsfragen von heute erfordern eine Informationstiefe, die über die Kapazität traditioneller PCR-Technologien hinausgeht. Die digitale PCR der dritten Generation verkleinert diese Lücke und wird zu einer wesentlich simpleren und praxistauglicheren Technik, um diese alltäglichen Forschungsfragen zu klären.

Das Konzept der digitalen PCR existiert seit etwa 1992, als Sykes et al.die „PCR mit limitierender Verdünnung“ beschrieben. Diese allgemeine Methode arbeitete mit Endpunktanalyse und Poisson-Statistik zur Quantifizierung der absoluten Zahl an in einer Probe vorliegenden Nukleinsäuremolekülen. 1999 folgte die revolutionäre Arbeit von Vogelstein und Kinzler, welche eine Methode entwickelten, bei der die Probe verdünnt und auf einzelne, Partitionen genannte Reaktionen aufgeteilt wurde. Nach der Amplifikation erfolgten Nachweis und Analyse einzelner Produkte mit Fluoreszenzsignal. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Begriff „digitale PCR“ geprägt, den wir heute alle kennen.

Über die Jahre wurden diese Methoden modernisiert und für eine breitflächige Adaptation kommerzialisiert. Die digitale PCR kann auf Mikrofluidik-Chips und -Tellern, auf Microarrays und in Mikrotröpfchen oder Tröpfchenkristallen auf Basis von Öl-Wasser-Emulsionen sowie neuerdings auch in qPCR-artigen Platten durchgeführt werden.

Die digitale PCR ist ein hochpräziser Ansatz zur sensitiven und reproduzierbaren Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren. Die Messungen werden nach Aufteilung der Probe in Partitionen vorgenommen, sodass in jeder Einzelreaktion entweder gar kein, nur ein oder mehrere Target-Moleküle vorliegen. Jede Partition wird im Anschluss an das Endpunkt-PCR-Thermocycling auf die Anwesenheit (positive Reaktion) oder Abwesenheit (negative Reaktion) eines Fluoreszenzsignals analysiert, woraus die absolute Anzahl der in der Probe vorliegenden Moleküle berechnet wird. Die Proben-Target-Quantifizierung erfolgt unabhängig von einer Standardkurve. Durch Eliminierung der Abhängigkeit von Standardkurven werden Fehler reduziert und die Präzision verbessert.

Teilen und gewinnen

Zwar wird die Probe genauso vorbereitet wie bei der qPCR, doch die Probenpartitionierung, bei der die Probe vor der Amplifikation in Tausende von Einzelreaktionen aufgeteilt wurde, ist ein Alleinstellungsmerkmal der digitalen PCR. Anders als bei der Massenanalyse in der qPCR wird bei der digitalen PCR durch zufällige Aufteilung der Moleküle in Partitionen der Effekt konkurrierender Targets minimiert, während zugleich die Präzision und Sensitivität des Nachweises seltener Targets steigen.

Sie erlaubt Forschern:

• Die Quantifizierung in geringer Menge vorliegender Targets oder von Targets mit komplexem Hintergrund
• Den Nachweis und die Unterscheidung von Allelvarianten (SNPs)
• Die Überwachung geringfügiger Veränderungen der Target-Konzentration, die mittels qPCR nicht nachweisbar wären

Poisson-Gesetz gibt der Partitionierung Bedeutung

Anders als die Real-time qPCR ist die digitale PCR nicht davon abhängig, dass in jedem Amplifikationszyklus die relative Menge an Target-Molekül bestimmt wird; stattdessen verlässt sie sich auf Poisson-Statistik zur Bestimmung der absoluten Target-Menge im Anschluss an eine Endpunkt-Amplifikation.

Da das Target-Molekül zufällig auf alle verfügbaren Partitionen verteilt ist, schätzt die Poission-Verteilung die durchschnittliche Anzahl an Molekülen je Partition (keines, eines oder mehrere) und berechnet die Kopien des Target-Moleküls je positiver Partition. Die statistische Poisson-Analyse der Anzahl positiver und negativer Reaktionen liefert eine präzise absolute Quantifizierung der Target-Sequenz.