Auswahl zwischen dPCR und qPCR – Erkunden Sie die Vorteile und finden Sie heraus, ob es für Ihre Forschungsziele passt
Beim Vergleich zwischen dPCR- und qPCR-Technologien ist der entscheidende Unterschied die Präzisionsleistung. Während beide eine hochsensitive und zuverlässige Nukleinsäuredetektion und -quantifizierung bieten, lässt sich der Hauptunterschied zwischen den beiden Technologien am besten anhand des Vergleichs von Analogradio und Digitalradio beschreiben, so Dr. Jim Hugget, Principal Scientist, National Measurement Laboratory. „Bei einem Analogradio muss zunächst das Einstellrad fein abgestimmt werden, um bei möglichst geringen Störungen die gewünschte Station zu erreichen. Trotzdem hängt die Qualität vom Empfang ab und das Signal unterliegt Störungen durch Rauschen. Das entspricht der qPCR. Sie ist zuverlässig, erfordert aber eine Optimierung, um gute Ergebnisse zu erhalten. Selbst dann ist Hintergrundrauschen unvermeidlich. Beim Digitalradio wird einfach die Station aufgerufen und sie ist entweder mit einem klaren Signal verfügbar oder eben nicht. Genauso ist es bei der dPCR, die präzise, binäre Ergebnisse liefert. Sie zählt wortwörtlich die An- oder Abwesenheit von DNA-Molekülen. Die Klarheit der Ergebnisse, kombiniert mit einer geringeren Fehlerrate, sorgt für eine unglaublich hohe Präzision. Die digitale PCR ist sehr gut zur Messung kleinerer quantitativer Unterschiede geeignet.“
Vergleich und Gegenüberstellung: qPCR vs. dPCR
| Real-time PCR/qPCR | Digitale PCR |
|---|---|
| Quantitativ, relativ oder absolut, aber Standardkurven oder Referenzproben sind erforderlich |
Quantitativ, absolut und keine Standards oder Referenzen erforderlich |
|
Massen-PCR
|
Probenpartitionierung
|
| Misst PCR-Amplifikation in jedem Zyklus | Misst nach Abschluss der PCR-Zyklen |
| Detektiert Mutationsraten > 1 % | Detektiert Mutationsraten von ≥ 0,1% (hohes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis) |
| Gut etablierte Protokolle | Höhere Präzision für höhere Reproduzierbarkeit von Labor zu Labor |
Wann ist dPCR und wann qPCR einzusetzen?
Wenn es bei der molekularbiologischen und Genomik-Forschung um die Quantifizierung von Nukleinsäuren geht, stehen Wissenschaftler häufig am Scheideweg. Welche Quantifizierungstechnik eignet sich besser, um die eigenen Forschungsziele möglichst effizient zu erreichen – die präzisere und robuste digitale PCR (dPCR) oder die standardisiertere und vertraute quantitative Real-time PCR (qPCR)? Beide Technologien haben Gemeinsamkeiten, aber auch jeweils eigene Vorzüge und Einschränkungen, die die Entscheidung anwendungsabhängig machen.
Das Anwendungsraster gibt den Grad der Eignung jeder Technologie für einige der gängigsten Anwendungen an.
Die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), eine der frühesten Formen der digitalen PCR, wies für die meisten der oben aufgeführten Applikationen bereits Vorzüge gegenüber der qPCR auf. Beim Vergleich ddPCR vs. qPCR eignet sich die qPCR für Applikationen, die einen breiten dynamischen Bereich erfordern, wohingegen die ddPCR für Applikationen zu bevorzugen ist, die eine höhere Präzision oder die Analyse der fraktionierten Abundanz erfordern.
Die Entwicklung von der ddPCR zur Nanoplatten-dPCR hat den Anwendungsbereich dieser Technologie erweitert, sodass nun noch mehr Applikationen möglich sind. Der Workflow der Nanoplatten-dPCR ist dank gleichzeitiger Auslesung aller Probenpartitionen, Front-End-Automation und der einfachen Platteneinrichtung ähnlich wie bei der qPCR deutlich schneller. Durch diese zusätzliche Geschwindigkeit eignet sich die Technologie für Screening- und Hochdurchsatz-Applikationen, ohne dass Abstriche bei Präzision, Genauigkeit und Sensitivität erforderlich sind.