scientist working on a computer
PCR digitale

dPCR vs qPCR

Choisir la PCR digitale ou la PCR quantitative
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Découvrez les avantages et voyez si cela répond à vos objectifs de recherche

Lorsqu’on compare les technologies de dPCR et de qPCR, la principale différence est la précision. Si les deux technologies proposent une détection et une quantification particulièrement sensibles et fiables des acides nucléiques, leur principale différence est comparable à celle de la radio analogique par rapport à la radio numérique, d’après le Dr Jim Huggett, Principal Scientist, National Measurement Laboratory. « Avec une radio analogique, il faut d’abord tourner le bouton pour trouver la station souhaitée sans trop d’interférences. La qualité dépend de la réception et le signal subit des interférences parasites. Ça, c’est la PCR quantitative. Elle est fiable mais nécessite une optimisation pour un résultat correct, et même après, il faut faire face à un bruit de fond. Avec la radio numérique, il suffit de demander la station pour la trouver, avec un signal net, ou pas. Ça, c’est la PCR digitale, qui offre des résultats binaires précis. Elle compte littéralement les molécules d’ADN présentes ou absentes. La clarté des résultats associée à un faible taux d’erreur lui confèrent un niveau incroyablement élevé de précision. La PCR digitale est parfaitement adaptée pour mesurer des différences quantitatives plus faibles. »

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Comparer et décider : qPCR vs. dPCR

Les chercheurs apprécient la rapidité, la sensibilité, la spécificité et la facilité d’utilisation de la PCR quantitative Cette technique est particulièrement utile pour l’analyse d’expression génique, la détection d’agents pathogènes et l’analyse du microbiome, ainsi que pour la validation des données de puces à ADN. Cependant, la PCR quantitative a montré ses limites dans des applications nécessitant une précision et une sensibilité supérieures, telles que l’analyse de variation du nombre de copies, la détection des mutations et SNP ainsi que la discrimination allélique. Dans de telles applications, la PCR digitale surpasse la PCR quantitative en permettant non seulement de mesurer le nombre de copies absolu mais aussi de dépasser les limites de détection, c’est-à-dire de détecter les différences de moindre ampleur exprimées à 10 % de précision et les taux de mutation < 1 %.

La PCR digitale permet également une quantification fiable, elle affiche ainsi une grande tolérance aux inhibiteurs de PCR et est moins perturbée par les variations d’efficacité de la PCR imputables au fractionnement d’échantillon et au cycle en point final.

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Real-Time PCR/qPCR PCR digitale
Quantitative, relative ou absolue mais les courbes
étalon ou les échantillons de référence sont nécessaires		 Quantitative, absolue et aucun étalon ni aucune référence
n’est nécessaire

PCR d'un volume d'échantillon important

  • Volumes réactionnels flexibles
  • Les variations d’efficacité de la PCR ont un impact
    car les données sont collectées en phase exponentielle
  • Sensibilité aux inhibiteurs

Fractionnement d’échantillon

  • Tolérance aux inhibiteurs
    supérieure/fiabilité accrue
  • Les variations d’efficacité de
    l’amplification n’ont aucun impact
  • Puissance statistique supérieure grâce
    à la loi de Poisson
Mesure l’amplification par PCR à chaque cycle Mesure à la fin des cycles de PCR
Détecte un taux de mutation de > 1 % Détecte un taux de mutation de ≥ 0,1% (rapport
signal/bruit élevé)
Protocoles bien établis Précision supérieure pour une reproductibilité supérieure
parmi les laboratoires

qpcr vs dpcr heparin
Les réactions de PCR digitale restent fiables même en présence d’inhibiteurs tels que l’acide humique et l’héparine. Les réactions de qPCR (sur le Rotor-Gene Q) et de PCR digitale (sur le QIAcuity) ont été effectuées en présence de quantités indiquées d’inhibiteurs à l’aide du QIAcuity PCR Master Mix (EvaGreen) correspondant et avec des volumes réactionnels identiques. La quantification affiche les Cq (qPCR) ou les copies/µl (dPCR) comme des différences de performances relatives parmi les échantillons avec l’échantillon non inhibé défini sur 100 %.
digital pcr vs qpcr humic acid
Les réactions de PCR digitale restent fiables même en présence d’inhibiteurs tels que l’acide humique et l’héparine. Les réactions de qPCR (sur le Rotor-Gene Q) et de PCR digitale (sur le QIAcuity) ont été effectuées en présence de quantités indiquées d’inhibiteurs à l’aide du QIAcuity PCR Master Mix (EvaGreen) correspondant et avec des volumes réactionnels identiques. La quantification affiche les Cq (qPCR) ou les copies/µl (dPCR) comme des différences de performances relatives parmi les échantillons avec l’échantillon non inhibé défini sur 100 %.
qpcr vs dpcr precision
1 Cq en qPCR, qui représente 50 % de précision, équivaut à 10 % de précision en PCR digitale et correspond à une augmentation de la concentration ×2.

Quand utiliser la dPCR plutôt que la qPCR ?

Concernant leur recherche en biologie moléculaire et en génomique impliquant la quantification des acides nucléiques, les scientifiques se trouvent souvent à la croisée des chemins. Quelle technique de quantification choisir pour réaliser leurs objectifs de recherche avec efficacité : la PCR digitale (dPCR), plus précise et plus fiable, ou la Real-Time PCR quantitative (qPCR), plus normalisée et plus familière ? Les deux technologies présentent des similitudes mais aussi des avantages et des limites, le choix dépend ainsi de l’application.

La grille d’applications ci-dessous indique le niveau d’adéquation de chaque technologie avec certaines des applications les plus courantes.

Rare mutation detection Copy number variation analysis Gene expression analysis miRNA expression analysis Microbial pathogen detection Viral load quantification Liquid biopsy GMO detection Genome edit detection NGS library quantification and validation Residual host cell quantification qPCR dPCR Applications Suitability level

La PCR digitale en gouttelettes (ddPCR), l’une des premières formes de PCR digitale, présentait déjà des avantages par rapport à la qPCR pour la plupart des applications susmentionnées. Dans le match ddPCR vs qPCR, la qPCR se révèle adaptée aux applications qui nécessitent une plage dynamique importante, tandis que la ddPCR est plus adaptée aux applications qui nécessitent une précision supérieure ou l’analyse de l’abondance des fractions.

L’évolution de la ddPCR en dPCR sur nanoplaques a élargi la portée de cette technologie afin d’intégrer davantage d’applications. La procédure de dPCR sur nanoplaques est nettement plus rapide grâce à la lecture simultanée de toutes les fractions d’échantillon, à l’automatisation frontale et à une configuration facile des plaques de type qPCR. Cette rapidité en fait une technologie adaptée au dépistage et aux applications à haut débit sans rogner sur la précision, l’exactitude et la sensibilité.

Découvrez ce que la PCR digitale peut vous apporter
La PCR digitale, et plus particulièrement la technologie sur nanoplaques de QIAGEN, peut répondre dès aujourd’hui à vos questions, en vous offrant toute une gamme d’applications.
Explorer les avantages

Des chercheurs présentent les avantages de la dPCR par rapport à la qPCR
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Voyez l’exemple de quelques études qui ont fait appel à la dPCR pour dépasser les limites de la qPCR.

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Mogens Kruhøffer, fondateur et PDG de BioXpedia, voit le potentiel des avancées technologiques pour accélérer la recherche de l’idée au chevet du malade, au bénéfice des patients. Son plus récent ajout au laboratoire, le QIAcuity, permettra à ses clients de fournir de meilleurs résultats encore plus rapidement.
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Décoder l’épidémiologie du paludisme grâce à la dPCR
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Le passage de la qPCR à la dPCR a permis au Dr Wang Nguitragool d’identifier plusieurs échantillons inconnus qui étaient impossibles à identifier avec le dosage standard.
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Identifier la génétique de l’obésité à l’aide de la dPCR
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Le Dr Johanna Andersson-Assarsson a utilisé la dPCR pour déterminer le nombre exact de copies d’un gène de l’obésité hautement variable avec un grand nombre de copies, la résolution avec la qPCR étant tout simplement insuffisante.
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La PCR digitale révèle les souches de COVID mutantes
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Lorsque la recherche sur le COVID-19 basée sur les eaux usées a été compromise par des problèmes techniques inhérents à la méthode utilisée, comme la RT-PCR quantitative et le séquençage d’ADN, les chercheurs de cette start-up française sont passés à la dPCR. Cela leur a permis non seulement de détecter les souches mutantes de façon précoce et fiable mais également de relier la quantité de SARS-CoV-2 détectée dans les eaux usées à la population infectée.
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Découvrez le lauréat de la bourse APHL dPCR 2021

Le Dr Abelardo Moncayo, directeur du programme des maladies à transmission vectorielle du département de la santé du Tennessee, est le lauréat 2021 de la bourse d’accès à la technologie PCR digitale de QIAGEN, en partenariat avec l’APHL. Découvrez comment il compte utiliser la PCR digitale pour orienter les stratégies de recherche et de surveillance contre les moustiques et les tiques.
Guide pour débutants en dPCR
Ces ressources ont pour but de guider au mieux le professionnel qui envisage de passer à la PCR digitale et de l’aider à planifier sa première expérience.
Pour commencer

Passer de la qPCR à la dPCR
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Grâce au QIAcuity Nanoplate Digital PCR System, toute la puissance de la dPCR devient accessible et plus abordable que jamais pour votre laboratoire.

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La nouvelle gamme de PCR digitale de QIAGEN – Pour résoudre les problèmes actuels de débit, vitesse et de facilité d’utilisation en PCR digitale
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Intervenant : Dr Gerald Schock, directeur des instruments de PCR digitale, QIAGEN
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Conseils et astuces pour la PCR digitale
Découvrez une compilation des 20 questions principales, ainsi que des réponses perspicaces, de notre webinaire invité.
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Questions fréquentes (FAQ) sur le passage de la qPCR à la dPCR

Comment le dosage est-il utilisé en dPCR par rapport au dosage en qPCR ?
Toutes les règles du dosage de Real-Time PCR s’appliquent également à la dPCR. Un dosage qui fonctionne bien en Real-Time PCR fonctionnera tout aussi bien en dPCR. On peut aisément transférer des dosages de SYBR en dPCR EvaGreen. Il convient néanmoins de choisir les conditions de cycle ainsi que les concentrations d’amorce/sonde recommandées pour la dPCR, comme indiqué dans les kits QIAcuity dPCR correspondants. À titre d’exemple, pour l’optimisation rapide de dosages non optimaux, en appliquant un gradient de température au cours des étapes de renaturation, on peut utiliser les Master Mix QIAcuity sur n’importe quel instrument de real-time PCR. N’hésitez pas à consulter notre Guide d’application QIAcuity pour plus de détails sur la conception des dosages.
Quelle est la différence entre qPCR et dPCR?

La différence entre qPCR et dPCR réside dans la façon de quantifier les acides nucléiques. La qPCR mesure l’amplification et utilise des courbes d’étalonnage pour déterminer la quantité d’acide nucléique dans l’échantillon. La dPCR divise l’échantillon en plusieurs milliers de fractions, collecte les données à la fin de chaque réaction puis utilise les statistiques pour obtenir le nombre absolu de molécules dans chaque réaction.

Quelle est la différence entre PCR digitale et RT-qPCR ?
La différence entre PCR digitale et qPCR en temps réel (RT-qPCR) réside dans la méthode de quantification. En RT-PCR, un échantillon d’ARN subit une transcription inverse en ADNc, qui est ensuite amplifié dans une réaction de PCR. En RT-qPCR, l’ADNc est quantifié en temps réel à l’aide des courbes d’étalonnage. En RT-dPCR, l’ADNc est mesuré à la fin de la réaction puis la quantification absolue est déterminée à l’aide de la loi de Poisson. Vous pouvez utiliser les deux méthodes pour analyser l’ARN et l’expression génique.
Une courbe d’étalonnage est-elle nécessaire pour la dPCR ?
En dPCR, on mesure la concentration absolue de cibles à la réaction finale. Les concentrations des valeurs inconnues peuvent être déterminées d’après les résultats de dPCR observés (nombre de négatifs, nombre de positifs et volume de fraction analysé).
Quels sont les avantages de la PCR digitale par rapport à la qPCR ?
La PCR digitale est souvent préférée à la qPCR, car elle ne nécessite pas de courbes d’étalonnage et n’est pas affectée par les différences entre le calibrateur et l’échantillon. La PCR digitale présente une efficacité de PCR élevée, elle est très précise et adaptée à la détection de cibles rares dans un fond important d’ADN non cible. La dPCR est en outre moins sensible aux inhibiteurs de PCR que la qPCR.
Pour quoi la qPCR est-elle utilisée ?

La qPCR est utilisée entre autres pour détecter les mutations rares (ADNtc), les séquences rares (charge virale et bactérienne, micro-ARN), les variations du nombre de copies, pour quantifier l’expression génique, pour le génotypage des SNP, pour vérifier les puces à ADN, pour valider les dosages, détecter les agents pathogènes et quantifier les banques de NGS.

Qu’est-ce que le qPCR et comment fonctionne-t-elle ?
La PCR quantitative (qPCR) est une méthode de quantification des acides nucléiques. La qPCR mesure l’amplification de l’ADN en temps réel par la surveillance de la fluorescence. À un certain point, l’intensité de la fluorescence s’accroît proportionnellement au nombre initial d’acides nucléiques matriciels dans l’échantillon. La quantité d’ADN cible est calculée à l’aide d’une courbe d’étalonnage définie d’après une série de dilutions d’un étalon à des concentrations connues.
Quel est l’inconvénient de la qPCR ?
L’inconvénient de la qPCR est que cette méthode est basée sur des courbes d’étalonnage. La réalisation de ces courbes demande du temps, des ressources et compromet l’efficacité de la PCR. La qPCR est une méthode moins précise, moins reproductible et plus sensible aux inhibiteurs de PCR et aux contaminants que la dPCR.
Puis-je utiliser le Master Mix de dPCR dans un thermocycleur de qPCR à des fins d’optimisation ?
Le Master Mix de dPCR peut être utilisé en qPCR pour optimiser la concentration d’échantillon et/ou la concentration d’amorce/sonde avant le transfert du dosage de la qPCR à la dPCR.