Marquage d’acides nucléiques

L’ADN polymérase I, encodée par le gène polA, fut la première ADN polymérase découverte et est la polymérase la plus abondante dans E. coli (environ 400 molécules par cellule). C’est un exemple d’enzyme processive en ceci qu’elle est capable de catalyser à la suite plusieurs étapes de polymérisation sans relâcher la matrice simple brin. Ce polypeptide présente deux régions d’action : une grande région (fragment de Klenow) qui contient la polymérase 5'→3' et l’exonucléase d’édition 3'→5', et un fragment plus petit qui contient une activité exonucléase 5'→3'. Cette dernière activité permet à l’ADN polymérase I d’éliminer les amorces d’ARN utilisées pour créer le fragment d’Okazaki. Les principales fonctions de la polymérase in vivo consistent à participer à la recombinaison et à la réparation de l’ADN. Pendant la réparation de l’ADN, l’ADN polymérase I comble les brèches dans l’ADN dues à l’élimination des lésions d’ADN. 

Les applications dans la recherche comprennent la translation de cassure dépendante de la DNase I, la synthèse du second brin dans le clonage de l’ADNc et le remplissage des surplombs 5´. L’ADN polymérase I contient des nucléotides biotinylés.

En raison de son activité exonucléase 5'→3', l’ADN polymérase I de E. coli n’est pas adaptée à de nombreuses applications. Le fragment de Klenow, la partie importante qui contient la polymérase 5'→3' et l’exonucléase d’édition 3'→5', ne présente pas une telle activité, ainsi il est intéressant pour les applications de recherche, notamment la synthèse de l’ADN double brin à partir de matrices simple brin, le remplissage des extrémités 3' en retrait de fragments d’ADN visant à rendre les extrémités des surplombs 5' franches, la digestion des surplombs 3' et la préparation de sondes d’ADN marquées. 

À l’instar de l’activité exonucléase 5'→3' de l’ADN polymérase I de E. coli, l’activité exonucléase 3'→5' du fragment de Klenow est parfois non souhaitable pour certaines applications. Ce problème est résolu en introduisant des mutations grâce auxquelles l’enzyme du fragment de Klenow (exonucléase 3'→5') conserve l’activité polymérase 5'→3' mais pas l’activité exonucléase. Le fragment de Klenow (exonucléase 3'→5') est utilisé dans certaines réactions avec marquage fluorescent sur puce à ADN, et dans l’extension homopolymérique dA et dT, une étape importante du processus de ligature des adaptateurs d’ADN aux fragments d’ADN, fréquemment utilisée pour préparer les banques d’ADN pour le séquençage à haut débit (NGS).

L’ADN polymérase T7 présente en soi une faible processivité. Elle se sépare d’une matrice d’amorce après l’ajout de < 15 nt. En cas d’infection à E. coli, le phage T7 annexe une protéine hôte, la thiorédoxine, pour s’en servir de facteur de processivité. L’ADN polymérase T7 et la thiorédoxine se lient pour former un même complexe et la liaison de la thiorédoxine à l’ADN polymérase T7 intensifie 80 fois l’affinité spécifique de la polymérase à une matrice d’amorce. La conséquence de cette affinité accrue pour une matrice d’amorce est la capacité de l’ADN polymérase T7 à rallonger une amorce sur l’ADN simple brin de plusieurs milliers de nucléotides sans dissociation, ce qui permet une synthèse continue des longs étirements d’ADN. L’ADN polymérase T7 peut être utilisée pour la purification de l’ADN circulaire en retirant l’ADN génomique résiduel, afin de synthétiser les brins d’ADN complémentaire. 

La polymérase poly(A), ou polynucléotide adénylyltransférase, catalyse l’intégration de résidus d’adénine dans les terminaisons 3’ de l’ARN en utilisant l’ARN simple brin comme amorce et en ajoutant une queue poly(A) à l’ARN. La polymérase poly(A) est une polymérase indépendante de la matrice, elle appartient à la grande superfamille des nucléotidyltransférases dans la famille X, qui comprend également la transférase terminale (TdT).

La polyadénylation est une étape primordiale de la maturation de l’ARNm ; les queues poly(A) à l’extrémité 3’ de l’ARNm facilitent le transport de l’ARNm depuis le noyau, améliorent l’efficacité de la traduction et augmentent la longévité de l’ARNm dans le cytoplasme. Dans les eucaryotes, l’appareil responsable de la polyadénylation est physiquement couplé à celui du clivage de l’ARNm. La création de l’extrémité 3’ polyadénylée d’un ARNm requiert un clivage endonucléolytique avant que le pré-ARNm soit polyadénylé par la polymérase poly(A). 

En biologie moléculaire, l’ajout de la queue poly(A) avec la polymérase poly(A) améliore la traduction de l’ARN transféré dans les cellules eucaryotes. Parmi les autres applications, on trouve l’extension homopolymérique poly(A) de l’ARN pour le clonage ou la purification d’affinité et le marquage 3’ de l’ARN à l’ATP ou la cordycépine, un analogue nucléosidique (désoxyadénosine 3’).