female scientist working out the results
디지털 PCR

초보자를 위한 dPCR

dPCR의 진화

오늘날의 복잡한 연구 목적에는 기존 PCR 기술의 용량을 넘어서는 심도 있는 정보가 필요합니다. 3세대 디지털 PCR은 이러한 격차를 줄이고 이러한 일상적인 연구 목적을 다루는 훨씬 간단하고 실용적인 기술이 되고 있습니다.

디지털 PCR의 개념은 1992년 Sykes et al.이 "제한 희석 PCR"로 기술한 후부터 존재해 왔습니다. 이 일반적인 방법은 검체에 존재하는 핵산 분자의 절대 수를 정량화하기 위해 종말점 분석 및 푸아송 통계를 사용했습니다. 그 후, 1999년 Vogelstein과 Kinzler의 혁신적인 작업으로, 검체를 희석하여 분획이라고 하는 개별 반응에 분배하고, 증폭 후 형광 신호가 있는 단일 산물을 검출하고 분석하는 방법을 개발했습니다. Vogelstein과 Kinzler가 오늘날 우리 모두가 알고 있는 "디지털 PCR"이라는 용어를 사용했습니다.

수년에 걸쳐 이러한 방법은 더 널리 채택될 수 있도록 혁신되고 상업화되었습니다. 미세유체 칩 및 디스크, 마이크로어레이 및 미세 방울 또는 유수 에멀젼을 기반으로 하는 방울 결정에 대해 디지털 PCR을 수행할 수 있으며, 더 최근에는 qPCR 유사 플레이트에서 수행할 수 있습니다.

dpcr breakthrou
디지털 PCR이란 무엇인가요?
디지털 PCR의 기초. 작동 방식, 이점 및 한계 요약, 적용 범위를 확인할 수 있습니다.
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디지털 PCR의 파워
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제품의 용도

dPCR benefits and applications image

디지털 PCR은 민감성 있고 재현성 있는 핵산 검출 및 정량화를 위한 매우 정밀한 방법입니다. 검체를 분획으로 나누어 측정을 수행하므로 개별 반응에는 표적 분자가 없거나 하나 이상 있습니다. 종말점 PCR 사이클링 후 형광 신호 존재(양성 반응) 또는 부재(음성 반응)에 대해 각 분획물을 분석하고, 검체 내 존재하는 분자의 절대 수를 계산합니다. 디지털 PCR은 검체 표적 정량화에 있어 표준 곡선에 의지하지 않습니다. 표준 곡선에의 의존을 하지 않음으로써 오류가 줄어들고 정밀도가 높아집니다.

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절대 정량화 4단계

검체 희석 및 PCR 반응 혼합물 설정
검체 희석 및 PCR 반응 혼합물 설정
파란색 - 표적 빨간색 - 배경(gDNA, cDNA; 프라이머/프로브; 마스터 혼합물)
수천 개의 개별 반응액으로 분획하는 PCR 반응
수천 개의 개별 반응액으로 분획하는 PCR 반응
분획물의 종말점 PCR 증폭
분획물의 종말점 PCR 증폭
녹색 - 양성 반응 파란색 - 음성 반응
리드아웃 및 절대 정량화
리드아웃 및 절대 정량화
나누어 정복하기

검체는 qPCR에서와 마찬가지로 준비하지만, 증폭 전에 검체를 수천 개의 개별 반응으로 나누는 검체 분획은 디지털 PCR에 고유합니다. qPCR의 대량 분석과 달리 분자를 분획으로 무작위로 분배함으로써 디지털 PCR은 표적 경쟁의 영향을 최소화하고 희귀 표적 검출의 정밀도와 민감도를 향상합니다.

이를 이용하여 연구자들이 다음을 할 수 있습니다.

  • 존재도가 낮은 표적 또는 복잡한 배경의 표적 정량화
  • 대립유전자 변이체(SNP) 검출 및 식별
  • qPCR로 검출할 수 없는 표적 수준의 작은 변화 모니터링
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분획의 상위 3가지 이점

유효 농도 증가
  • 검출 한계(limit of detection, LOD) 개선
  • 단일 표적 분자 증폭 및 검출
농축 효과 부여
  • 표적 대 배경 – 비율 증가
우월한 정밀도 및 선형성 제공
  • 전체(ensemble) 농도 대비 개별 분자 측정
  • 분획을 많이 할수록 정밀도가 높아짐
  • 분획을 많이 할수록 동적 범위 넓어짐
qPCR 대비 dPCR 선택
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dpcr target molecules per partition
푸아송의 법칙은 분획에 의미를 부여합니다

Real-time qPCR과 달리 디지털 PCR은 표적 분자의 상대적인 양을 결정하기 위해 모든 증폭 주기에 의존하지 않습니다. 대신, 푸아송 통계에 의존하여 종말점 증폭 후 절대적인 표적 양을 결정합니다.

표적 분자가 사용 가능한 모든 분획에 무작위로 분포되기 때문에 푸아송 분포는 분획당 평균 분자 수(0, 하나 이상)를 추정하고 양성 분획당 표적 분자의 사본 수를 계산합니다. 양성 및 음성 반응의 수에 대한 푸아송 통계 분석으로 표적 시퀀스의 정밀하고 절대적인 정량을 산출합니다.

절대 정량화에 통계 적용

디지털 PCR 실험의 맥락에서, 절대 정량화는 분획 전체에 걸친 표적 분자의 무작위 분포에 의존하며 데이터를 푸아송 분포에 피팅합니다. 푸아송 분포는 1837년 프랑스 수학자 Siméon Denis Poisson의 이름을 따서 명명되었으며 사건이 알려진 일정한 비율로 발생하고 이전 사건의 발생과 독립적인 경우 고정된 기간에 주어진 수의 사건 확률에 적용됩니다.


Given: V alid pa r titions: 8000 Positive partitions: 4000 λ = −ln number of valid partitions ‒ number of positive partitions number of valid partitions λ = −ln 8000 ‒ 4000 8000 = 0.693 Calculated target copies per partition λ = −ln number of valid partitions ‒ number of positive partitions number of valid partitions Given: P a r tition volume is V = 0. 2 3 nl λ volume = λ V [µ l ] 1 000 = 3013 copies/µl Calculated target copies per µl λ volume = 0.693 0.23 x Simple mathematical computation of the Poisson law for a digital PCR experiment looks like this: λ is t h e expectation value for t h ese events and will tell what t h e most li k ely ave r age value of copies/pa r titions is Computing the estimated concentration of target genes in copies/µl
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디지털 PCR에 관한 FAQ에 대한 빠른 답변

절대 정량화와 상대 정량화의 차이점은 무엇인가요?
디지털 PCR을 사용한 절대 정량화는 단순히 검체 내에 존재하는 분자의 수를 계산합니다. 알려진 표준은 필요하지 않습니다. qPCR에서 표준 곡선 방법을 사용하는 절대 정량화에서는 알려진 양을 사용하여 미지수를 정량화합니다. 상대 정량화는 참조 검체를 사용하여 관심 대상 반응 내 템플릿 DNA의 원본 사본 수를 참조 검체에 대비하여 비교하여 측정합니다.
PCR 기술의 응용 분야는 무엇인가요?
PCR 기술의 응용 분야에는 표적 핵산의 존재 또는 부재 확인, 유전형 분석, 유전자 발현 정량화, 분석 검증, 미생물 표적 검출, 차세대 염기서열 분석(Next-Generation Sequencing, NGS) 라이브러리 정량화 등이 포함됩니다.
dPCR은 얼마나 정확한가요?
디지털 PCR은 핵산을 정량화하는 정확한 방법입니다. 연구에 따르면 dPCR은 특히 억제제 또는 야생형 개체군이 있는 경우 적은 수의 복제본을 분석하거나 단일 분자를 계산할 때 정밀도를 크게 높입니다. 디지털 PCR은 기존 qPCR에 비해 검출 한계가 낮고 실험실 내 재현성이 높습니다.
dPCR의 작용 방식은 무엇인가요?
초기 dPCR 반응은 qPCR과 비슷한 친숙한 분석 구성요소를 사용하여 이루어짐을 알면 안심이 될 것입니다. 그러나, 각 검체를 다수의 개별 및 평행 반응으로 불연속화 또는 분획화하면, 일부 분획에서는 1개 이상의 표적 분자가 있고 다른 분획에는 표적 분자가 없게 될 수 있습니다. 분획은 검체를 모세관이나 채널이 포함된 마이크로플레이트, 소형화 채널 배열 또는 미세 방울로서의 유수 에멀젼으로 나눠 이루어질 수 있습니다. 각 분획물은 종말점까지 PCR 증폭이 진행됩니다. 증폭 산물이 있는 분획과 증폭 산물이 없는 분획물을 개별적으로 계수합니다. 증폭 산물을 포함하고 형광 신호를 나타내는 분획물은 양성으로 지정하고 "1"로 매기며 증폭 산물이 없고 배경 신호만 나타내는 분획물은 음성으로 지정하며 "0"으로 매깁니다. 그 다음 푸아송 통계 분석을 적용하여 기준물질이나 표준품에 의존하지 않고 초기 검체 내에 존재하는 표적의 절대 농도를 측정합니다.
어떤 공정에서 dPCR 사용으로 이점을 누릴 수 있나요?
희귀 사건 검출, 사본 수 변이 분석 및 존재도가 낮은 전사체의 유전자 발현 분석과 같이 소량의 투입 핵산 검출 또는 표적 양의 더 미세한 분리도가 필요한 공정에서 dPCR의 분획 효과로부터 상당한 이점을 누릴 수 있습니다. 액상 생검, 단일 세포 분석, NGS 라이브러리 정량화, 낮은 바이러스 및 박테리아 부하의 정량화, 유전자 편집 사건 분석 및 GMO 검출과 같은 공정에서도 qPCR에 비해 디지털 PCR이 제공하는 뛰어난 정밀도와 높은 민감도를 활용할 수 있습니다. 대부분의 연구자에게 dPCR은 qPCR에 대한 상보적 방법이 됩니다.
어떤 유형의 템플릿을 dPCR에 사용할 수 있나요?
혈액, 조직, 세포, 종양, 세포 배양, 도말 및 세척액에서 분리된 유전체 DNA, FFPE DNA(포르말린 고정 파라핀 포함 DNA), cfDNA(순환 유리 DNA), ctDNA(순환 종양 DNA), 바이설파이트 처리 DNA, 환경 DNA, cDNA, 박테리아 DNA, 바이러스 DNA, 플라스미드 DNA, 라이브러리 DNA, 그리고 gBlocks 및 더 긴 올리고뉴클레오티드와 같은 합성 DNA부터 총 RNA, microRNA, lncRNA, 바이러스 RNA, 박테리아 RNA 및 체외 전사 RNA에 이르는 시재료를 사용할 수 있습니다.
디지털 PCR은 디지털 미세방울 PCR(Digital Droplet PCR, ddPCR)과 같은가요?
아니요, 디지털 PCR은 디지털 미세방울 PCR(Digital Droplet PCR, ddPCR)뿐만 아니라 모든 디지털 PCR 방법을 포괄하는 용어입니다. 예를 들어 ddPCR은 PCR 검체 분획으로 미세방울을 사용하는 반면 다른 디지털 PCR 방법에서는 미세유체 플레이트, 미세유체 칩 또는 기타 원리를 기반으로 합니다.
디지털 PCR이 일반 PCR과 다른 점은 무엇인가요?
일반 PCR에 대한 정의에 따라 다릅니다. End-point PCR은 핵산의 정성적 또는 반정량적 분석을 위해 젤 전기영동법을 사용합니다. 정량적 PCR(Quantitative PCR, qPCR)은 표준 곡선을 기반으로 핵산 농도를 실시간으로 측정할 수 있습니다. 디지털 PCR은 end-point PCR을 분할 및 통계와 결합하여 핵산의 절대 정량화를 제공합니다.
디지털 PCR 검사란?
디지털 PCR 검사는 핵산을 절대 정량화하는 방법입니다. PCR 반응은 표적 핵산이 개별적으로 증폭되는 수천 개의 분획으로 나뉩니다. 형광 프로브 또는 염료를 사용하여 각 분획에서 생성물 유무를 검출합니다.
디지털 PCR과 ddPCR의 차이점은 무엇인가요?
디지털 PCR과 미세방울 디지털(Droplet Digital PCR, ddPCR)의 차이점은 분할 방식에 있습니다. 나노플레이트 dPCR의 경우 검체는 미세 유체 dPCR 플레이트에서 수천 개의 분획으로 나뉩니다. 미세방울 디지털 PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)에서는 검체를 수천에서 수백만 개의 미세방울로 나눈 다음 미세방울 판독기에서 하나씩 분석합니다.
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